一,、基本原理
　　微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過(guò)程中,，必須使微生物的代謝處于zui不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài),，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力,。
　　低溫,、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以,，菌種保藏方法雖多,，但都是根據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)的。
　　保藏方法大致可分為以下幾種：
1．傳代培養(yǎng)保藏法
　又有斜面培養(yǎng),、穿刺培養(yǎng),、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細(xì)菌用），培養(yǎng)后于4—6℃冰箱內(nèi)保存,。
2．液體石蠟覆蓋保藏法
　是傳代培養(yǎng)的變相方法,，能夠適當(dāng)延長(zhǎng)保藏時(shí)間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟,，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡,，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用,。
3．載體保藏法
　是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體,，如土壤、沙子,、硅膠,、濾紙上，而后進(jìn)行干燥的保藏法,，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛,。
4．寄主保藏法
　用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，如病毒,、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動(dòng)物,、昆蟲(chóng),、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法,。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏,。
5．冷凍保藏法
　可分低溫冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）,、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法,。
6．冷凍干燥保藏法
　先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）,。
　有些方法如濾紙保藏法,、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護(hù)劑來(lái)制備細(xì)胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對(duì)細(xì)胞的損害,。保護(hù)性溶質(zhì)可通過(guò)氫和離子鍵對(duì)水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型,。保護(hù)劑有牛乳、血清,、糖類,、甘油、二甲亞砜等,。
二,、器材
　　細(xì)菌、酵母菌,，放線菌和霉菌,；
　　肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，滅菌脫脂牛乳,，滅菌水,，化學(xué)純的液體石蠟，甘油,，五氧化二磷,，河沙，瘦黃土或紅土,，冰塊,、食鹽，干冰,，95％酒精,，10％鹽酸，無(wú)水氯化鈣,；
　　滅菌吸管,，滅菌滴管,，滅菌培養(yǎng)皿，管形安瓿管,，淚滴形安瓿管（長(zhǎng)頸球形底）,，40目與 100目篩子，油紙,，濾紙條（0．5×1．2cm）,，干燥器，真空泵,，真空壓力表,，噴燈，L形五通管,，冰箱,，低溫冰箱（-30℃），液氮冷凍保藏器,。
三,、操作步驟、各保藏法的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)
　　下列各法可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體條件與需要選做,。
1．斜面低溫保藏法
　　將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上,，待菌充分生長(zhǎng)后，棉塞部分用油紙包扎好,，移至2—8℃的冰箱中保藏,。
　　保藏時(shí)間依微生物的種類而有不同，霉菌,、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2—4個(gè)月,，移種一次。酵母菌兩個(gè)月,，細(xì)菌每月移種一次,。
　　此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法，優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單,，使用方便,，不需特殊設(shè)備，能隨時(shí)檢查所保藏的菌株是否死亡,、變異與污染雜菌等,。缺點(diǎn)是容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理,、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的,，屢次傳代會(huì)使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀,；污染雜菌的機(jī)會(huì)亦較多,。
2．液體石蠟保藏法
（1）將液體石蠟分裝于三角燒瓶?jī)?nèi),，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎,，1．05kg/cm2>,，121．3℃滅菌30分鐘,，然后放在40℃溫箱中,，使水汽蒸發(fā)掉，備用,。
（2）將需要保藏的菌種,，在zui適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子,。
（3）用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟,，注入已長(zhǎng)好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn),，使菌種與空氣隔絕,。
（4）將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時(shí)間還要長(zhǎng)）,。
　　此法實(shí)用而效果好,。霉菌、放線菌,、芽孢細(xì)菌可保藏2年以上不死,，酵母菌可保藏1—2年，一般無(wú)芽孢細(xì)菌也可保藏1年左右,，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌,，在37℃溫箱內(nèi)，亦可保藏3個(gè)月之久,。此法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡(jiǎn)單,，不需特殊設(shè)備，且不需經(jīng)常移種,。缺點(diǎn)是保存時(shí)必須直立放置,，所占位置較大，同時(shí)也不便攜帶,。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后,，接種環(huán)在火焰上燒灼時(shí)，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺,，應(yīng)特別注意,。
3．濾紙保藏法
（1）將濾紙剪成0．5×1．2cm的小條，裝入0．6×8cm的安瓿管中,，每管1—2張,，塞以棉塞,，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘,。
（2）將需要保存的菌種,，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長(zhǎng),。
（3）取滅菌脫脂牛乳1—2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi),，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液,。
（4）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi),，使其吸飽，再放回至安瓿管中,，塞上棉塞,。
（5）將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干,。
（6）將棉花塞入管內(nèi),，用火焰按圖Ⅶ-13熔封，保存于低溫下,。
（7）需要使用菌種,，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，可將安瓿管口在火焰上燒熱,，滴一滴冷水在燒熱的部位,，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃,，待安瓿管開(kāi)啟后,，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi),，置溫箱中培養(yǎng),。
　　細(xì)菌、酵母菌,、絲狀真菌均可用此法保藏,，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14—17年之久,。此法較液氮,、冷凍干燥法簡(jiǎn)便，不需要特殊設(shè)備,。
4．沙土保藏法
（1）取河沙加入10％稀鹽酸,，加熱煮沸30分鐘，以去除其中的有機(jī)質(zhì),。
（2）倒去酸水,，用自來(lái)水沖洗至中性,。
（3）烘干，用40目篩子過(guò)篩,，以去掉粗顆粒,，備用。
（4）另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土,，加自來(lái)水浸泡洗滌數(shù)次,，直至中性。
（5）烘干,，碾碎,，通過(guò)100目篩子過(guò)篩,，以去除粗顆粒,。
（6）按一份黃土、三份沙的比例（或根據(jù)需要而用其他比例,，甚至可全部用沙或全部用土）摻合均勻,，裝入10×100mm的小試管或安瓿管中，每管裝1g左右,，塞上棉塞,，進(jìn)行滅菌，烘干,。
（7）抽樣進(jìn)行無(wú)菌檢查,，每10支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中,，37℃培養(yǎng)48小時(shí),，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌,，再作無(wú)菌試驗(yàn),，直至證明無(wú)菌，方可備用,。
（8）選擇培養(yǎng)成熟的（一般指孢子層生長(zhǎng)豐滿的,，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好）優(yōu)良菌種，以無(wú)菌水洗下,，制成孢子懸液,。
（9）于每支沙土管中加入約0．5ml（一般以剛剛使沙土潤(rùn)濕為宜）孢子懸液，以接種針拌勻,。
（10）放入真空干燥器內(nèi),，用真空泵抽干水分，抽干時(shí)間越短越好,，務(wù)使在12小時(shí)內(nèi)抽干,。
（11）每10支抽取一支,，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒，接種于斜面培養(yǎng)基上,，進(jìn)行培養(yǎng),，觀察生長(zhǎng)情況和有無(wú)雜菌生長(zhǎng)，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長(zhǎng),，則說(shuō)明制作的沙土管有問(wèn)題,，尚須進(jìn)一步抽樣檢查。
（12）若經(jīng)檢查沒(méi)有問(wèn)題,，用火焰熔封管口,，放冰箱或室內(nèi)干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況,。
（13）需要使用菌種,，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi),，置溫箱中培養(yǎng),。
　　此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌、放線菌,，因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用zui廣,，效果亦好，可保存2年左右,，但應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞效果不佳,。
5．液氮冷凍保藏法
（1）準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂,，因此,，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的,，或能容1．2mm液體的,。
（2）加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí),，則將空安瓿管塞上棉塞,，1．05kg/cm2，121．3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液,，加入量以能浸沒(méi)以后加入的菌落圓塊為限,，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌15分鐘,。
（3）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液,，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊,，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi),，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無(wú)漏洞,。
（4）凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃,。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶,，因而降低存活率,。
（5）保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器（圖Ⅶ-14）的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi),。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃,，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。
（6）恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí),，將安瓿管取出,，立即放入38—40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止,。再打開(kāi)安瓿管,，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
　　此法除適宜于一般微生物的保藏外,，對(duì)一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體,、氫細(xì)菌,、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長(zhǎng)期保藏,，而且性狀不變異,。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。
6．冷凍干燥保藏法
（1）準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造,，形狀可用長(zhǎng)頸球形底的,，亦稱淚滴型安瓿管（圖Ⅶ-15），大小要求外徑6—7．5mm,，長(zhǎng)105mm,，球部直徑9—11mm，壁厚0．6—1．2mm,。也可用沒(méi)有球部的管狀安瓿管,。塞好棉塞，1．05kg/cm2>,，121．3℃滅菌30分鐘,，備用。
（2）準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種,，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年,，為了在許多年后不出差錯(cuò)，故所用菌種要特別注意其純度,，即不能有雜菌污染,，然后在zui適培養(yǎng)基中用zui適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物,。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,，若用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低,。一般,，細(xì)菌要求24—48小時(shí)的培養(yǎng)物；酵母需培養(yǎng)3天,；形成孢子的微生物則宜保存孢子,；放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7—10天。
（3）制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例,，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中,，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0．2ml,。
（4）冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售,，價(jià)值昂貴，此處介紹的是簡(jiǎn)易方法與裝置,，可達(dá)到同樣的目的,。
　　將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無(wú)低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2>）酒精液或干冰丙酮液,，溫度可達(dá)-70℃,。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4—5分鐘,，即可使懸液結(jié)冰,。
（5）真空干燥為在真空干燥時(shí)使樣品保持凍結(jié)狀態(tài)，需準(zhǔn)備冷凍槽,，槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽,，混合均勻，可冷至-15℃,。裝置儀器如圖Ⅶ-16,，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶?jī)?nèi)。
　　抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能達(dá)到93．3Pa（0．7mmHg）真空度時(shí),，則干燥物不致熔化,，以后再繼續(xù)抽氣，幾小時(shí)內(nèi)，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥,，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg）,，保持壓力6—8小時(shí)即可。
（6）封口抽真空干燥后,，取出安瓿管,，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（圖Ⅶ-17）繼續(xù)抽氣,，約10分鐘即可達(dá)到26．7Pa（0．2mmHg）,。于真空狀態(tài)下，以煤氣噴燈的細(xì)火焰在安瓿管頸*進(jìn)行封口,。封口以后,，保存于冰箱或室溫暗處。
　　此法為菌種保藏方法中zui有效的方法之一,，對(duì)一般生活力強(qiáng)的微生物及其孢子以及無(wú)芽胞菌都適用,，即使對(duì)一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存,。適用于菌種長(zhǎng)期保存,，一般可保存數(shù)年至十余年，但設(shè)備和操作都比較復(fù)雜,。
四,、實(shí)驗(yàn)報(bào)告