一、基本原理

流式細胞儀檢測細胞凋亡：PI單染色法其原理主要是根據(jù)細胞凋亡時在細胞,、亞細胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變。這些改變包括細胞核的改變,、細胞器的改變、細胞膜成分的改變和細胞形態(tài)的改變等,，其中細胞核的改變特征性,，主要包括以下幾個方面：

1、細胞核的改變

由于凋亡細胞核的改變,，造成各種染色體熒光染料對凋亡細胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明,，用各種染色體熒光染料對經(jīng)固定的凋亡細胞進行染色,，其DNA可染性降低。許多學者把這種DNA可染性的降低認為是凋亡細胞的標志之一,。

2,、光散射特性

凋亡細胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細胞儀上,，前散射光與細胞的大小有關,，而側散射光反映的是光在細胞內的折射作用，與細胞內的顆粒多少有關,。在細胞凋亡時,，細胞固縮，體積變小,，故前散射光降低,，這一特性往往被認為是凋亡細胞的特點之一。此外細胞凋亡時由于染色體降解,，核破裂形成,，細胞內顆粒往往增多，故凋亡細胞側散射光常增加,。細胞壞死時,，由于細胞腫脹，其前散射光增大;側散射光在細胞壞死時也增大,，因此可根據(jù)前散射光和側散射光區(qū)別凋亡細胞和壞死細胞,。但需要注意的是，根據(jù)前散射光和側散射光判斷凋亡細胞的可靠性受被檢測細胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細胞凋亡中,，用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好,，而在腫瘤細胞凋亡中，其可靠性就較差,。根據(jù)光散射特性檢測凋亡細胞zui主要的優(yōu)點是可以將光散射特性與細胞的表面免疫熒光分析結合起來,，用以區(qū)別經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細胞亞型。也可用于活細胞的分類,。

二,、試劑與儀器

1、PBS溶液

2,、PI染液：將PI溶于PBS（pH7.4）中,，終濃度為100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存

3,、70%乙醇

4,、400目篩網(wǎng)

5、流式細胞儀

三,、實驗步驟

1,、收集細胞{數(shù)目約（1~ 5）×106個/mL｝，500~ 1000 r/min離心5min,，棄去培養(yǎng)液,。

2、3ml PBS洗滌1次,。

3,、離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定,，4℃,，1—2小時。

4,、離心棄去固定液,，3mlPBS重懸5min。

5,、400目的篩網(wǎng)過濾1次,，500—1000r/min離心5min，棄去PBS,。

6,、用1ml PI染液染色，4℃避光30min,。

7,、流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發(fā)熒光,，激光光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm,，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點圖,。

8、結果判斷：在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上,，凋亡細胞與正常細胞相比,，前散射光降低，而側散射光可高可低,，與細胞的類型有關;在分析PI熒光的直方圖時,，先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發(fā)微弱熒光的細胞碎片，在PI熒光的直方圖上,，凋亡細胞在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體峰,。如以G1/G0期所在位置的熒光強度為1.0，則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45,，可用雞和鮭魚的紅細胞的PI熒光強度做參照標準,，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞,。

四,、注意事項

細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一,，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發(fā)生改變所致,。在分析結果時應該注意,。