利用SPA-sepharose cl-4b 親合層析法分離純化IgG抗體
免疫球蛋白分離的方法很多,IgG分離純化時(shí)多采用離子交換法,,本文就采用SPA-sepharose cl-4b 親合層析法分離純化IgG的原理,、試劑、操作步驟以及注意事項(xiàng)進(jìn)行了總結(jié),。
一,、原理
葡萄球菌a蛋白(SPA)具有與多種哺乳動(dòng)物IgG分子fc段結(jié)合的能力,并與不同IgG亞類(lèi)的結(jié)合力有所差別,。改變pH及離子強(qiáng)度可洗脫結(jié)合于SPA-sepHarose cl-4b 柱上的IgG或不同的IgG亞類(lèi),,可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體,。
二,、試劑器材
1、spa-sepharose cl-4b (pharmacia-sigma)
2,、磷酸緩沖液0.1mol/l pH8.6+0.02% NaN3
3,、枸櫞酸緩沖液
0.1mol/l pH5.5 0.1mol/l pH4.0
0.1mol/l pH3.0 分別+0.02% NaN3
4、1mol/l pH9.0 tris-HCl溶液
5,、再生緩沖液
(1)0.1mol/l tris含0.5mol/l NaCl調(diào)整pH至8.6+0.02% NaN3;
(2)0.1mol/l 醋酸鈉含0.5mol/l NaCl調(diào)整pH至2.2+0.02%NaN3,。
三,、操作步驟
1.用0.1mol/l pH8.6磷酸緩沖液浸泡SPAF-sepharose cl-4b凝膠,15min,。按1g干膠200ml上述緩沖液充分洗滌凝膠,,(用玻璃漏斗過(guò)濾或置燒杯中洗滌)。
2.裝柱后用0.1mol/l pH8.6磷酸緩沖液平衡,。
3.標(biāo)本可用硫酸銨粗提物,,先10000g離心除去雜質(zhì),必要時(shí)用0.22μm濾膜過(guò)濾,,上樣前用1mol/l pH9.0 tris-HCl 液調(diào)整標(biāo)本液pH至8.6或?qū)ζ胶庖和肝觥?/p>
4.加樣,,一般按25~30mg IgG/g濕膠比例加樣,室溫作用15min,,用0.1mol/l pH8.6磷酸緩沖液充分淋洗,,到淋洗液OD值為<0.02。
5.用不同pH的枸櫞酸洗脫液洗脫,,流速20ml/h,。如純化小鼠IgG1一般用pH5.5;純IgG2a用pH4.0 ;純化IgG2b用pH3.0
6.用(2)再生緩沖液洗脫剩余蛋白,洗脫后用(1)再生緩沖液平衡完成再生
7.收集洗脫液測(cè)OD值,,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要透析除鹽后進(jìn)行濃度,、純度和活性測(cè)定。
四,、注意事項(xiàng)
1,、PA-sepharose cl-4b凝膠價(jià)格昂貴,可再生后反復(fù)使用10~20次左右,。
先用10倍柱體積0.1mol/l pH8.6 tris含0.5mol/l NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白;再用10倍柱體積0.1mol/l pH4.5醋酸鈉緩沖液含0.5mol/l NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白;0.1mol/l pH8.0磷酸緩沖液平衡,,4℃貯存。
2,、SPA-sepharose cl-4b親合層析法還可用于
(1)除去抗體液中IgG,,檢測(cè)非IgG抗體(如IgM)的生物學(xué)活性
(2)除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段
(3)吸收或純化免疫復(fù)合物
3、狗,、貓的多克隆IgM和IgA以及單克隆IgM和IgA也具有與SPA結(jié)合的能力,。
使用PA-sepharose cl-4b分離純化IgG主要有以下三個(gè)優(yōu)點(diǎn):一、操作簡(jiǎn)單,,可進(jìn)行大規(guī)模操作,;二、純化產(chǎn)率高,、特異性強(qiáng),;三、使用范圍廣,,可以純化IgG,,也可以用于純化IgM,,但是主要的缺點(diǎn)就價(jià)格比較貴。
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