免疫組化操作規(guī)程

（一）、儀器設(shè)備
   1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐,；
    2）水浴鍋

（二）,、試劑
    1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L,，Na2HPO4 4.3mmol/L,， KH2PO4 1.4mmol/L。
    2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB,，pH6.0,，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g,。
    3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,，用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。
    4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿,，用1N的HCl調(diào)至pH8.0,加水至1000ml,。
    5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制,。 b,、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
    6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制,。
    7）封裱劑：
    a,、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；
    b,、油和TBS（或PBS）配制,。 
    8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用于熒光顯微鏡標(biāo)本,；pH7.0～7.4適合于光學(xué)顯微鏡標(biāo)本,。

（三）、操作流程
    1,、脫蠟和水化
    脫蠟前,，應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘,。
    1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；
    2）無(wú)水乙醇中浸泡5分鐘,；
    3）95%乙醇中浸泡5分鐘,；
    4）70%乙醇中浸泡5分鐘,；
    2、抗原修復(fù)
   用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片,。
   1）抗原熱修復(fù)
   （1）高壓熱修復(fù) 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）,。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進(jìn)行鎖定,。將玻片置于金屬染色架上,，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘,，然后將蓋子鎖定,，小閥門將會(huì)升起來(lái)。10分鐘后,，去除熱源,，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開(kāi)蓋子,。本方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù),。
   （2）煮沸熱修復(fù) 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘,。
   （3）微波熱修復(fù) 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入,，斷電，間隔5~10分鐘,，反復(fù)1-2次,。適用的抗原有：AR，Bax,，Bcl-2,，C-fos，X-jun,，C-kit,，C-myc，E-cadherin,，Chromogranin A,，Cyclin，ER,，Heat shock protein,，HPV，Ki-67,，MDMZ,，p53，p34,，p16,，p15,，P-glycoprotein，PKC,，PR,，PCNA，ras,，Rb,，TopoismeraseⅡ等。
   2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液,。胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37℃,，切片也預(yù)熱至37℃，消化時(shí)間約為5~30分鐘,；胃蛋白酶消化37℃時(shí)間為30分鐘,。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen,，Complement,，Cytokeratin，C-erB-2,，GFAP,，LCA，LN等,。
    3,、免疫組織化學(xué)染色
    SP法
    1）脫蠟、水化,；
    2）PBS洗2～3次各5分鐘,；
    3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘,；
    4）PBS洗2～3次各5分鐘,；
    5）抗原修復(fù)；
    6）PBS洗2～3次各5分鐘,；
    7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘,。甩去多余液體。
    8）滴加Ⅰ抗50μl,，室溫靜置1小時(shí)或者4℃過(guò)夜或者37℃1小時(shí),。
    9）4℃過(guò)夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘。
    10）PBS洗3次各5分鐘,；
    11）滴加Ⅱ抗40～50μl,，室溫靜置，或37℃1小時(shí),；
    12）II抗中可加入0.05%的tween-20,。
    13）PBS洗3次各5分鐘；
    14）DAB顯色5～10分鐘,，在顯微鏡下掌握染色程度,；
    15）PBS或自來(lái)水沖洗10分鐘；
    16）蘇木精復(fù)染2分鐘,，鹽酸酒精分化,；
    17）自來(lái)水沖洗10～15分鐘；
    18）脫水,、透明,、封片、鏡檢,。
    SABC法
    1）脫蠟,、水化。
    2）PBS洗兩次各5分鐘,。
    3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2,，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次,。
    4）抗原修復(fù),。
    5）PBS洗5分鐘。
    6）滴加正常山羊血清封閉液,，室溫20分鐘,。甩去多余液體。
    7）滴加Ⅰ抗,室溫1小時(shí)或者4℃過(guò)夜或者37℃1小時(shí)（4℃過(guò)夜后在37℃復(fù)溫45分鐘）,。
    8）PBS洗三次每次2分鐘,。
    9）滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。
    10）PBC洗3次每次2分鐘,。
    11）滴加試劑SABC,，20℃～37℃20分鐘。
    12）PBS洗4次每次5分鐘,。
    13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）,。
    14）蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘,、鹽酸酒精分化,。
    15）脫水、透明,、封片,、鏡檢。