經過抗體測定的陽性孔,，可以擴大培養(yǎng),，進行克隆，以得到單個細胞的后代分泌單克隆抗體,?？寺〉臅r間一般說來越早越好。因為在這個時期各種雜交瘤細胞同時旺盛生長,，互相爭奪營養(yǎng)和空間,，而產生抗體的細胞有被淹沒和淘汰的可能。但克隆時間也不宜太早,，太早細胞性狀不穩(wěn)定,，數量少也易丟失。克隆化的陽性雜交瘤細胞,，經過一段時期培養(yǎng)之后,，也還會因為細胞突變或特定染色體的丟失，使部分細胞喪失產生抗體的能力,，所以需要再次或多次克隆化培養(yǎng),。克隆化次數的多少由分泌能力強弱和抗原的免疫性強弱而決定,。一般說,，免疫性強的抗原克隆次數可少一些，但至少要3～5次克隆才能穩(wěn)定,?？寺』姆椒ê芏啵ㄓ邢尴♂尫?、顯微操作法,、軟瓊脂平板法及熒光激活分離法等。

（一）有限稀釋法1.材料（1）微量培養(yǎng)盤,，盤內各孔于克隆化前一天培養(yǎng)小鼠腹腔細胞（即飼養(yǎng)細胞）每孔2萬～4萬。（2）HT培養(yǎng)基2.操作方法（1）取出抗體陽性孔細胞,，用HT培養(yǎng)液制成細胞懸液,。并取樣進行臺盼蘭染色，計數,。（2）用HT培養(yǎng)液將細胞稀釋成200個/ml,、40個/ml、20個/ml和的懸液,。（3）用吸管將細胞懸液分別種入微量培養(yǎng)盤,，每孔0.05ml，細胞含量分別為10個/孔,、2個/孔,、1個/孔和0.5個/孔。（4）5%CO2飽和濕度,，37℃培養(yǎng),。（5）每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長情況，選擇只有一個集落生長的孔,，棄掉兩個以上和沒有細胞生長的孔,。（6）克隆大量繁殖后，布滿孔底的1/3～1/2時,，測培養(yǎng)液抗體,。（7）抗體陽性孔細胞，移到有飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)瓶中，并傳2～4代就可以脫離飼養(yǎng)細胞,，建成克隆株,。

（二）軟瓊脂克隆化借助撒在軟瓊脂上單個細胞定位生長，而達到克隆化,，具體操作如下：1.配2.5%的瓊脂糖30ml,，水浴溶化后，移入45℃水浴中,。2.將117ml*DMEM液和3ml 10倍濃度的DMEM液混合,，置45℃水浴預熱。3.將瓊脂糖與DMEM液混合,，即為含0.5%瓊脂糖的*DMEM液,，并加75×108 脾細胞。4.每塊平皿加10ml,，于室溫中凝固,。5.DMEM中的細胞與DMEM—瓊脂1:1混合，將細胞瓊脂混合物2ml鋪于凝固的平板上,，使其全部覆蓋,。 6.放入CO2箱飽和濕度，37℃培養(yǎng)10天,。 7.用PBS配制0.6%瓊脂糖,，于沸水浴溶解后，置45℃,，在保溫情況下取一試管,，迅速加入0.1ml 25%羊紅血球，0.2ml豚鼠補體,，2.7ml 0.6%瓊脂糖,。 8.用3ml瓊脂糖—羊紅血球混合液覆蓋克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h,。從克隆上部溶解羊紅血球的溶血范圍,，可篩選抗羊紅血球Ig。

（三）顯微鏡操作法 在直徑6cm培養(yǎng)皿中,，加入1ml 1.0×108細胞懸液放置5%CO2飽和濕度,，37℃溫箱中放置30min以上，倒置顯微鏡下,，尋找那些與周圍相距甚遠的單個細胞,，將毛細管口（一頭有直角彎頭毛細管，一頭連接一尺長乳膠管,，用口控制液體進入）水平置放于液面上,，左右微動,，直到看見管口，對準細胞,，吸入毛細管,，將管中細胞移到預先加有2.0×104~5.0×104飼養(yǎng)細胞96孔板內，培養(yǎng)后,，即可獲得單個細胞形成的克隆,。

（四）熒光激活分離法用一種熒光激活細胞分類器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS）,。其基本原理是：將細胞經熒光抗體染色后,，經噴嘴形成單個細胞的線形液滴，在萊塞光激發(fā)下,，熒光素發(fā)射熒光,，此信號由光電倍增管接收，再結合細胞形態(tài)大小產生光散射信號,，經電腦處理,，產生信號并與預定的信號對比，根據細胞熒光強度及細胞大小不同,，將細胞分成不同級別,，在電場中發(fā)生偏離，而分別收集于不同容器中,。