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地高辛標(biāo)記cRNA探針實(shí)驗(yàn)方法

來(lái)源:上海韻涵生物科技有限公司   2010年03月02日 16:19  

       組織前處理在組織制片中以冷凍切片(厚10~30μm)*。切片貼在預(yù)先清潔,,高溫處理并涂以粘附劑載玻片上,,先在37℃預(yù)干燥4h,,然后置于37℃烤箱中過(guò)夜,。經(jīng)過(guò)上述處理的切片如在-20℃可保存2~3周,在-70℃可保存數(shù)月之久,,有報(bào)告可保存數(shù)年之久的,。但仍以新鮮制片為好。如為石蠟包埋切片,,應(yīng)脫蠟經(jīng)梯度酒精入水,。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在細(xì)胞內(nèi)mRNA含量高時(shí)應(yīng)用二甲苯脫蠟后仍能顯示,。經(jīng)水洗后入37℃烤箱4h或過(guò)夜,,然后進(jìn)行雜交前處理。

  在烘烤及低溫保存時(shí),,為防塵埃及空氣中RNA酶的污染,,宜用錫箔紙(foilpaper)包被,內(nèi)加少許干燥劑(變色硅膠),。
  下列步驟所需玻璃器皿均需消毒,,操作者需戴手套。
 ?。?)PBS洗2×3min,。
  (2)選擇少數(shù)幾張切片作為“RNA酶對(duì)照片”,。
  其它切片暫放于PBs 內(nèi),。
  RNA酶對(duì)照片處理方法:加RNA酶(100μg/ml)在預(yù)熱37℃的溶液內(nèi)。放在潮濕的盛有少許2×SSC塑料盒或蒸發(fā)皿內(nèi),。在每張切片上覆以過(guò)量的RNA酶溶液,,在37℃孵育30min后用2×SSC沖洗,2×3min,,然后與其它保存在PBS的切片一起進(jìn)行下列處理,。
  (3)蛋白酶K消化:將組織切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0,內(nèi)含蛋白酶K1μg/ml,,孵育15~20min,。消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織的種類,厚度反復(fù)試驗(yàn)調(diào)整,。時(shí)間過(guò)短探針不易進(jìn)入,,過(guò)長(zhǎng)影響細(xì)胞或組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
 ?。?)0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min終止蛋白激酶K反應(yīng)。0.25%乙酸酐(0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min,。
 ?。?)在4%多聚甲醛/PBS3min。
 ?。?)以PBs 漂洗2×3min,。
  (7)浸入新鮮配制的0.25%乙酸酐(0.1mol/L三乙醇胺配制)10min,,以封閉非特異性結(jié)合部位,。
  (8)2×SSC漂洗15min,。

 

  2.雜交以含cRNA探針(0.5ng/ml)的雜交液,,按每張切片10~2μl的量覆蓋切片。地高辛配基標(biāo)記的cRNA核酸探針保存濃度為2.5ng/ml,,用前稀釋備用,。覆以硅化蓋玻片或塑料蠟?zāi)ぃ糜谑⒂猩倭?×SSC溫盒內(nèi)在42℃,,16~18h或過(guò)夜,。

3.顯示
  (1)用緩沖液1沖洗雜交后的載片2×3min,。
 ?。?)在緩沖液1中10min,室溫以封閉非特異性結(jié)合部位,。
 ?。?)拭干切片周圍的載片,注意保持切片濕潤(rùn),。加數(shù)滴抗地高辛抗血清(工作濃度1:500,,以緩沖液1稀釋),孵育2h,,室溫,。
  (4)緩沖液1漂洗3×3min。
 ?。?)浸入緩沖液210min室溫,。
  (6)浸入底物中孵育10~30min(或更長(zhǎng)時(shí)間,,視需要而定),,底物內(nèi)含顯色BCIP/NBT,室溫,。用錫箔紙包裹反應(yīng)盒,,使顯色在黑暗中進(jìn)行。定期取出切片在顯微鏡下檢測(cè)反應(yīng)強(qiáng)度,。根據(jù)反應(yīng)強(qiáng)度決定延長(zhǎng)或終止反應(yīng),。反應(yīng)顏色為紫藍(lán)色。
 ?。?)將切片浸入緩沖液3以終止反應(yīng),。
  (8)復(fù)染,,可用1%伊紅,、1%蘇木精、1%亮綠或5%的焦寧(又稱派咯寧丫)(pyronin 丫)10~30s,。
 ?。?)流水洗5~10min,直至水無(wú)色為止,。
 ?。?0)在切片未干前,以PBS/甘油封固切片,,如要*保存,,可以用DPX在蓋片四周封固。為去除水份,,在封固前可進(jìn)行梯度酒精脫水,,透明,DPX封固,,但每步時(shí)間僅需幾秒鐘,,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易致褪色。

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