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毛細管色譜柱的使用技術(shù)及常見故障
1．毛細管的安裝
毛細管柱的安裝常為人們所忽視,，往往會出現(xiàn)作填充色譜柱多年的技術(shù)人員,，剛使用毛細管柱時,，做出的色譜圖還不如填充柱的色譜圖,，這使人們很難理解,。但究其原因，多數(shù)是由于毛細管柱的安裝和操作上的毛病,，而不是柱子本身和儀器系統(tǒng)的問題,。因此，一根好的毛細管柱和設(shè)計得很好的色譜系統(tǒng),，還必須使柱子在系統(tǒng)中安裝得合理,，才能做出好的結(jié)果。
1.1毛細管柱與進樣器的連接對于分流進樣,，毛細管柱的入口端一定要伸過分流進樣器的分流出口（圖1A）,，亦就是使毛細管柱的入口處于載氣的高流速區(qū)域。如果毛細管柱的入口在分流進樣器的分流出口以下（圖1B）,，處于載氣的低流速區(qū)域,，得到的色譜圖還不如填充柱，所以必須將毛細管的入口伸過分流進樣器的分流出口，這樣才會得到尖銳的峰形,。對于分流/不分流進樣,，毛細管的入口應(yīng)接到進樣器的底部（圖1c）這樣可以使汽化管中的樣品*進入柱子，也不會出現(xiàn)氣流清洗不到的“死區(qū)”,。
圖1A,、B、C毛細管柱與進樣器的連接示意圖
1.2毛細管柱與檢測器的連接
在毛細管連接到檢測器之前,，先接通載氣,，看一下柱子的出口是否有載氣通過，（將柱子出口浸入清水中看是否有氣泡出現(xiàn)）如果沒有載氣從柱子出來,，說明柱前的系統(tǒng)中有的地方漏氣或柱子堵塞,，應(yīng)找出原因加以解決。然后將柱子的未端盡可能的伸到檢FID）的噴嘴以下的1~2厘米處（但不能超過噴嘴如圖2 ,，并使柱子的出口處于氣流的zui高流速區(qū)域（即氫氣引入口以上）,，如果柱子不能直接伸到檢測器的噴嘴下1~2厘米處，但必須伸到尾吹氣入口的上部使柱子的未端處于氣流的高速區(qū)域,。
圖2 毛細管柱與檢測器的連接示意圖
1.3分流比的測定與選擇
分流比可以定義：樣品*汽化時與載氣充分混合后,，樣品通過分流進樣器進入柱子的流量FC與通過分流器的流量F分流之比：分流比= FC/F分流（式1）有的人把分流比定義為：樣品進入汽化室后，進樣器中總的流速=FC十F 分流與柱流速FC之比：分流=FC/FC +F分流（式2）例如,，柱子出口流速為1ml/分,，分流器放空的流速為99ml／分，則分流比為100:1 ,，因為柱流速FC比分流流速小所以（式1）,、（式2）的結(jié)果很相近，FC和F 分流可通過皂沫流量計測量,。如果載氣通過毛細管柱的流量很小,，用皂沫流量計不容易測，FC也可以通過計算求出： FC= 60uπr2 其中u為載氣的平均線速度,，單位厘米／秒,。u可以通過進樣后用某物質(zhì)的保留時間求得，某物質(zhì)可以用甲烷,、甲醇等均可,，要求是色譜柱對該物質(zhì)的吸附要小，一般以甲烷為宜,，具體計算方法為：u=柱長（厘米）/保留）分流比及分流有大小靠分流閥進行調(diào)節(jié),，選擇適當(dāng)?shù)姆至鞅纫埠苤匾Ｈ绻至鞅群苄?，樣品大多?shù)進入柱子,、容易使峰變寬,，形成前伸峰。分流比一般選擇在1:100~200之間,，這時樣品的起始組分的譜帶擴展很小,，出峰尖銳。對一根0.25mm內(nèi)徑的毛細管,，用N2作載氣,，*流速0.3~0.4ml/分，則分流流量調(diào)到50ml/分左右即可,。在毛細管分流進樣系統(tǒng)中一般以柱頭壓力來恒量柱流量的大小,，下表給出一些常用的毛細管柱在標準線速度的情況下的柱頭壓力：
上表所使用的載氣為氮氣,，線速度為20cm/秒,。或氫氣,，線速度為40cm/秒,。
1.4尾吹氣流量的測量與選擇
毛細管色譜分析用FID檢測器時，一定要加尾吹氣,，一般用空氣或N2氣,。加尾吹氣的作用之一是減少柱后死體積對色譜峰造成的擴散，之二是保證FID有合適的氮氫比,。FID系質(zhì)量型檢測器,，適當(dāng)?shù)卦黾游泊禋饪商岣邫z測的靈敏度（圖3），但尾吹氣太高,，會引起基線不穩(wěn)以至滅火,，尾吹氣太低，會引起色譜峰拖尾,、對毛細管柱效損失大大,。尾吹氣流量一般在20-30ml比較適合，可用皂沫流量計來測量,。
圖3尾吹氣流速對峰高的影響
1.5 毛細管柱的老化
涂漬好的毛細管柱首先要經(jīng)過充分的老化,，以除去固定液中的低分子量物質(zhì)，一般商品毛細管柱,，在制造出廠前都已經(jīng)過充分老化,；但柱子一經(jīng)從儀器上拆卸下來，較長時間接觸空氣,，在下一次使用之前,，以較低的初始溫度程序升溫至zui高使用溫度老化2—3次。各種固定液因其性質(zhì)和生產(chǎn)廠家不同而zui高使用溫度有所不同,，所以要注意毛細管柱的說明,，生產(chǎn)毛細管柱的廠家應(yīng)注明zui高使用溫度。老化中應(yīng)注意載氣的流速不易過大，否則會破壞均勻的液膜,。一般非極性柱在250℃以下老化使用,，可用普通氮氣，在250℃以上高溫使用時,，必須使用高純氮氣或普通氮氣經(jīng)脫氧后使用,，以延長柱子的使用壽命。對極性柱,，尤其是PEG類（聚乙二醇）,、FFAP、含氰基的固定液（OV225,、•OV275）,，一定要用高純氮氣（高純氮氣經(jīng)過脫氧，）99.99%否則,，固定液很快被氧化,，以致不能使用。
1.6交聯(lián)毛細管柱的清洗
交聯(lián)毛細管柱zui重要的優(yōu)點是當(dāng)柱被可溶性有機重組分污時,，可以用溶劑清洗除去污染物,，使柱得以再生，根據(jù)污染的性質(zhì),，可適用非極性溶劑（如正戊烷）或極性浴劑（如二氯甲烷,、丙酮、苯等）,。每個試驗室都可以做一簡單設(shè)備,，如（圖4）來進行清洗。清洗方法：將溶劑裝入小瓶的2/3處,，把毛細管的出口端（接檢測器的一端）刺過青霉素的橡皮蓋插入溶劑底部,。（青霉橡皮蓋較硬，不易被彈性石英毛細管刺透,，可用一金屬絲或注射針預(yù)先刺透,，在留的痕跡處插入石英毛細管）。接著用25ml或50ml的注射針,，向小瓶內(nèi)壓入空氣,，溶液即會壓入柱內(nèi)，直全部溶劑從柱中流出,，（如果是20米以上的大口徑毛細管柱,，再加一次溶劑清洗） 隨后，將柱從小瓶中拉出與儀器的進樣連接,，用載氣將柱中的溶劑吹干后,，再把柱的另一端與檢測連接,。用程序升溫的方式老化l～2次，即可使用,。清洗過程應(yīng)注意：①溶劑必須用分析純試劑,；②溶劑在柱浸泡時間不能過長，以防止固定液液膜溶漲,，使柱效下降,。
1．25或50ml注射器 2．青霉素小瓶 3．毛細管柱
圖4清洗方法示意圖
1.7毛細管色譜分析中常見故障及排除
1.7.1進樣不出峰
這是zui常見的問題之一，主要原因有以下凡個方面：漏氣：進樣隔墊,、柱子兩端的接頭以及放空針形閥前的連接處漏氣,。火焰熄滅：調(diào)節(jié)氫氣或尾吹氣流量的大小,，看記錄筆是否向一邊偏移,，如筆不動，說明火熄了或火沒點著,。電路不正常：離子線,、放大器,、記錄儀連線接錯或接觸不好,，放大器有問題。系統(tǒng)堵塞：在上述情況均正常時應(yīng)懷疑系統(tǒng)堵塞,，樣品沒有進到檢測器,，先檢查柱后是否有氣流通過，如果沒有氣流通過,，可能柱子堵塞,，從柱后折斷1~2厘米，仍不通氣,，再檢查柱前是否堵塞,，在確認柱子通氣的情況下，檢查柱子到檢測器的連接管路是否堵塞,。尾吹氣沒加上：調(diào)節(jié)尾吹流量,，如果記錄筆不動（在保證火點著和儀器正常情況下），應(yīng)懷疑流量不夠,。關(guān)掉氫氣和空氣,，噴嘴口若沒有氣流，證明是氣路堵塞或尾吹管路堵塞,。靈敏度太低,；可能高壓沒加上，絕緣不好等儀器本身的問題,，也有操作上的原因,，高阻太低,，衰減大大，記錄儀滿刻度毫伏數(shù)大大等,。毛細管色譜常用10 ~10 歐姆的高阻,，衰減盡可能小，記錄儀滿刻度1毫伏（噪音可允許的情況下）,。如果記錄儀滿刻度只有5毫伏或10毫伏,，衰減可相應(yīng)小一些或高阻高一擋。另外,，柱子從中間斷開,。樣品濃度大低、放空流量太大,。注射針堵塞等原因都可能造成不出峰,。
1.7.2色譜峰拖尾，如（圖5）
圖5拖尾峰和前伸峰
拖尾峰引起的原因比較復(fù)雜,，毛細管柱和儀器系統(tǒng)都可能引起拖尾柱子兩端安裝不正確,，沒有超過分流點和尾吹點；或者是安裝好后又在接頭處斷裂,；柱外死體積較大,；尾吹氣流量小，樣品在柱內(nèi)或者系統(tǒng)內(nèi)壁非線性吸附,；汽化室污染,，此時應(yīng)檢查柱子的連接是否正確，有無斷裂,，尾吹氣流量是否合適,，強極性組份在金屬、載體,、固定液和載氣以及固定液和玻璃界面上都會發(fā)生吸附作用,，這些表面吸附作用可以通過表面純化來解決。是將系統(tǒng)全玻璃化,，并使用石英毛細管柱,，或?qū)悠愤m當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)化。圖5拖尾峰和前峰前伸峰是由于進樣量太大,，柱子超負荷,，進樣器或柱溫太低引起的、只要提高儀器的靈敏度,，減小進樣量,，提高進樣器溫度或柱溫，就能或少解決色譜峰的前伸問題,。
1．毛細管的安裝
毛細管柱的安裝常為人們所忽視,，往往會出現(xiàn)作填充色譜柱多年的技術(shù)人員,，剛使用毛細管柱時,，做出的色譜圖還不如填充柱的色譜圖,，這使人們很難理解,。但究其原因，多數(shù)是由于毛細管柱的安裝和操作上的毛病,，而不是柱子本身和儀器系統(tǒng)的問題,。因此，一根好的毛細管柱和設(shè)計得很好的色譜系統(tǒng),，還必須使柱子在系統(tǒng)中安裝得合理,，才能做出好的結(jié)果。
1.1毛細管柱與進樣器的連接對于分流進樣,，毛細管柱的入口端一定要伸過分流進樣器的分流出口（圖1A）,，亦就是使毛細管柱的入口處于載氣的高流速區(qū)域。如果毛細管柱的入口在分流進樣器的分流出口以下（圖1B）,，處于載氣的低流速區(qū)域,，得到的色譜圖還不如填充柱，所以必須將毛細管的入口伸過分流進樣器的分流出口，這樣才會得到尖銳的峰形,。對于分流/不分流進樣,，毛細管的入口應(yīng)接到進樣器的底部（圖1c）這樣可以使汽化管中的樣品*進入柱子，也不會出現(xiàn)氣流清洗不到的“死區(qū)”,。
圖1A,、B、C毛細管柱與進樣器的連接示意圖
1.2毛細管柱與檢測器的連接
在毛細管連接到檢測器之前,，先接通載氣,，看一下柱子的出口是否有載氣通過，（將柱子出口浸入清水中看是否有氣泡出現(xiàn)）如果沒有載氣從柱子出來,，說明柱前的系統(tǒng)中有的地方漏氣或柱子堵塞,，應(yīng)找出原因加以解決。然后將柱子的未端盡可能的伸到檢FID）的噴嘴以下的1~2厘米處（但不能超過噴嘴如圖2 ,，并使柱子的出口處于氣流的zui高流速區(qū)域（即氫氣引入口以上）,，如果柱子不能直接伸到檢測器的噴嘴下1~2厘米處，但必須伸到尾吹氣入口的上部使柱子的未端處于氣流的高速區(qū)域,。
圖2 毛細管柱與檢測器的連接示意圖
1.3分流比的測定與選擇
分流比可以定義：樣品*汽化時與載氣充分混合后,，樣品通過分流進樣器進入柱子的流量FC與通過分流器的流量F分流之比：分流比= FC/F分流（式1）有的人把分流比定義為：樣品進入汽化室后，進樣器中總的流速=FC十F 分流與柱流速FC之比：分流=FC/FC +F分流（式2）例如,，柱子出口流速為1ml/分,，分流器放空的流速為99ml／分，則分流比為100:1 ,，因為柱流速FC比分流流速小所以（式1）,、（式2）的結(jié)果很相近，FC和F 分流可通過皂沫流量計測量,。如果載氣通過毛細管柱的流量很小,，用皂沫流量計不容易測，FC也可以通過計算求出： FC= 60uπr2 其中u為載氣的平均線速度,，單位厘米／秒,。u可以通過進樣后用某物質(zhì)的保留時間求得，某物質(zhì)可以用甲烷,、甲醇等均可,，要求是色譜柱對該物質(zhì)的吸附要小，一般以甲烷為宜,，具體計算方法為：u=柱長（厘米）/保留）分流比及分流有大小靠分流閥進行調(diào)節(jié),，選擇適當(dāng)?shù)姆至鞅纫埠苤匾Ｈ绻至鞅群苄?，樣品大多?shù)進入柱子,、容易使峰變寬,，形成前伸峰。分流比一般選擇在1:100~200之間,，這時樣品的起始組分的譜帶擴展很小,，出峰尖銳。對一根0.25mm內(nèi)徑的毛細管,，用N2作載氣,，*流速0.3~0.4ml/分，則分流流量調(diào)到50ml/分左右即可,。在毛細管分流進樣系統(tǒng)中一般以柱頭壓力來恒量柱流量的大小,，下表給出一些常用的毛細管柱在標準線速度的情況下的柱頭壓力：
上表所使用的載氣為氮氣,，線速度為20cm/秒,。或氫氣,，線速度為40cm/秒,。
1.4尾吹氣流量的測量與選擇
毛細管色譜分析用FID檢測器時，一定要加尾吹氣,，一般用空氣或N2氣,。加尾吹氣的作用之一是減少柱后死體積對色譜峰造成的擴散，之二是保證FID有合適的氮氫比,。FID系質(zhì)量型檢測器,，適當(dāng)?shù)卦黾游泊禋饪商岣邫z測的靈敏度（圖3），但尾吹氣太高,，會引起基線不穩(wěn)以至滅火,，尾吹氣太低，會引起色譜峰拖尾,、對毛細管柱效損失大大,。尾吹氣流量一般在20-30ml比較適合，可用皂沫流量計來測量,。
圖3尾吹氣流速對峰高的影響
1.5 毛細管柱的老化
涂漬好的毛細管柱首先要經(jīng)過充分的老化,，以除去固定液中的低分子量物質(zhì)，一般商品毛細管柱,，在制造出廠前都已經(jīng)過充分老化,；但柱子一經(jīng)從儀器上拆卸下來，較長時間接觸空氣,，在下一次使用之前,，以較低的初始溫度程序升溫至zui高使用溫度老化2—3次。各種固定液因其性質(zhì)和生產(chǎn)廠家不同而zui高使用溫度有所不同,，所以要注意毛細管柱的說明,，生產(chǎn)毛細管柱的廠家應(yīng)注明zui高使用溫度。老化中應(yīng)注意載氣的流速不易過大，否則會破壞均勻的液膜,。一般非極性柱在250℃以下老化使用,，可用普通氮氣，在250℃以上高溫使用時,，必須使用高純氮氣或普通氮氣經(jīng)脫氧后使用,，以延長柱子的使用壽命。對極性柱,，尤其是PEG類（聚乙二醇）,、FFAP、含氰基的固定液（OV225,、•OV275）,，一定要用高純氮氣（高純氮氣經(jīng)過脫氧，）99.99%否則,，固定液很快被氧化,，以致不能使用。
1.6交聯(lián)毛細管柱的清洗
交聯(lián)毛細管柱zui重要的優(yōu)點是當(dāng)柱被可溶性有機重組分污時,，可以用溶劑清洗除去污染物,，使柱得以再生，根據(jù)污染的性質(zhì),，可適用非極性溶劑（如正戊烷）或極性浴劑（如二氯甲烷,、丙酮、苯等）,。每個試驗室都可以做一簡單設(shè)備,，如（圖4）來進行清洗。清洗方法：將溶劑裝入小瓶的2/3處,，把毛細管的出口端（接檢測器的一端）刺過青霉素的橡皮蓋插入溶劑底部,。（青霉橡皮蓋較硬，不易被彈性石英毛細管刺透,，可用一金屬絲或注射針預(yù)先刺透,，在留的痕跡處插入石英毛細管）。接著用25ml或50ml的注射針,，向小瓶內(nèi)壓入空氣,，溶液即會壓入柱內(nèi)，直全部溶劑從柱中流出,，（如果是20米以上的大口徑毛細管柱,，再加一次溶劑清洗） 隨后，將柱從小瓶中拉出與儀器的進樣連接,，用載氣將柱中的溶劑吹干后,，再把柱的另一端與檢測連接,。用程序升溫的方式老化l～2次，即可使用,。清洗過程應(yīng)注意：①溶劑必須用分析純試劑,；②溶劑在柱浸泡時間不能過長，以防止固定液液膜溶漲,，使柱效下降,。
1．25或50ml注射器 2．青霉素小瓶 3．毛細管柱
圖4清洗方法示意圖
1.7毛細管色譜分析中常見故障及排除
1.7.1進樣不出峰
這是zui常見的問題之一，主要原因有以下凡個方面：漏氣：進樣隔墊,、柱子兩端的接頭以及放空針形閥前的連接處漏氣,。火焰熄滅：調(diào)節(jié)氫氣或尾吹氣流量的大小,，看記錄筆是否向一邊偏移,，如筆不動，說明火熄了或火沒點著,。電路不正常：離子線,、放大器,、記錄儀連線接錯或接觸不好,，放大器有問題。系統(tǒng)堵塞：在上述情況均正常時應(yīng)懷疑系統(tǒng)堵塞,，樣品沒有進到檢測器,，先檢查柱后是否有氣流通過，如果沒有氣流通過,，可能柱子堵塞,，從柱后折斷1~2厘米，仍不通氣,，再檢查柱前是否堵塞,，在確認柱子通氣的情況下，檢查柱子到檢測器的連接管路是否堵塞,。尾吹氣沒加上：調(diào)節(jié)尾吹流量,，如果記錄筆不動（在保證火點著和儀器正常情況下），應(yīng)懷疑流量不夠,。關(guān)掉氫氣和空氣,，噴嘴口若沒有氣流，證明是氣路堵塞或尾吹管路堵塞,。靈敏度太低,；可能高壓沒加上，絕緣不好等儀器本身的問題,，也有操作上的原因,，高阻太低,，衰減大大，記錄儀滿刻度毫伏數(shù)大大等,。毛細管色譜常用10 ~10 歐姆的高阻,，衰減盡可能小，記錄儀滿刻度1毫伏（噪音可允許的情況下）,。如果記錄儀滿刻度只有5毫伏或10毫伏,，衰減可相應(yīng)小一些或高阻高一擋。另外,，柱子從中間斷開,。樣品濃度大低、放空流量太大,。注射針堵塞等原因都可能造成不出峰,。
1.7.2色譜峰拖尾，如（圖5）
圖5拖尾峰和前伸峰
拖尾峰引起的原因比較復(fù)雜,，毛細管柱和儀器系統(tǒng)都可能引起拖尾柱子兩端安裝不正確,，沒有超過分流點和尾吹點；或者是安裝好后又在接頭處斷裂,；柱外死體積較大,；尾吹氣流量小，樣品在柱內(nèi)或者系統(tǒng)內(nèi)壁非線性吸附,；汽化室污染,，此時應(yīng)檢查柱子的連接是否正確，有無斷裂,，尾吹氣流量是否合適,，強極性組份在金屬、載體,、固定液和載氣以及固定液和玻璃界面上都會發(fā)生吸附作用,，這些表面吸附作用可以通過表面純化來解決。是將系統(tǒng)全玻璃化,，并使用石英毛細管柱,，或?qū)悠愤m當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)化。圖5拖尾峰和前峰前伸峰是由于進樣量太大,，柱子超負荷,，進樣器或柱溫太低引起的、只要提高儀器的靈敏度,，減小進樣量,，提高進樣器溫度或柱溫，就能或少解決色譜峰的前伸問題,。
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