PCR儀的 基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:
1、模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,,為下輪反應(yīng)作準備,; 2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,,溫度降至55℃左右,,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合; 3,、引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈",,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍(Plateau),。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝,。 在此同時認識到蛋白質(zhì)是接受RNA的遺傳信息而合成的。50年代Zamecnik等在形態(tài)學(xué)和分離的亞細胞組分實驗中已發(fā)現(xiàn)微粒體(microsome)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的部位,;1957年Hoagland,、Zamecnik及Stephenson等分離出tRNA并對它們在合成蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)運氨基酸的功能提出了假設(shè);1961年Brenner及Gross等觀察了在蛋白質(zhì)合成過程中mRNA與核糖體的結(jié)合,;1965年Holley測出了酵母丙氨酸t(yī)RNA的一級結(jié)構(gòu),;特別是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學(xué)家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質(zhì)的遺傳密碼,,隨后研究表明這套遺傳密碼在生物界具有通用性,,從而認識了蛋白質(zhì)翻譯合成的基本過程。 從分子生物學(xué)的發(fā)展過程,,可以看到在近半個世紀中它是生命科學(xué)范圍發(fā)展zui為迅速的一個前沿領(lǐng)域,,推動著整個生命科學(xué)的發(fā)展。至今分子生物學(xué)仍在迅速發(fā)展中,,新成果,、新技術(shù)不斷涌現(xiàn),但分子生物學(xué)的歷史還短,,積累的資料還不夠,。例如:在地球上千姿萬態(tài)的生物攜帶龐大的生命信息,迄今人類所了解的只是極少的一部分,,還未認識核酸,、蛋白質(zhì)組成生命的許多基本規(guī)律,;又如即使到2005年我們已經(jīng)獲得人類基因組DNA3×109bp的全序列,確定了人的5-10萬個基因的一級結(jié)構(gòu),,但是要*搞清楚這些基因產(chǎn)物的功能,、調(diào)控、基因間的相互關(guān)系和協(xié)調(diào),,要理解80%以上不為蛋白質(zhì)編碼的序列的作用等等,,都還要經(jīng)歷漫長的研究道路??梢哉f分子生物學(xué)的發(fā)展前景光輝燦爛,,道路還會艱難曲折。 平或放大真核細胞單拷貝基因,,通過PCR方法都是不難完成的,。 4、特異性強 作為引物的寡核苷酸與模板結(jié)合的正確性是決定反應(yīng)產(chǎn)物是否特異的關(guān)鍵,。 5,、對原始材料質(zhì)量要求低含微量(pg,ng)的目的DNA的粗制品或者總RNA,就可以用做反應(yīng)起始材料來獲取目的產(chǎn)物,。 主要適用于生命科學(xué),、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué),、環(huán)境科學(xué),、考古學(xué)及歷史事件解讀和衛(wèi)生安全方面
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