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| Agilent 1100 LC現場培訓教材 |
| 一,、培訓目的： ● 基本了解1100LC硬件操作,。 ● 掌握化學工作站的開機,，關機,，參數設定,學會數據采集,數據分析的基本操作。 二,、培訓準備： 1,、儀器設備： Agilent 1100LC ● G1310A :（單元泵）；G1312A（二元泵）,；G1311A（四元泵）,。 ● G1313A（自動進樣器）。 ● G1316A（柱溫箱）,。 ● G1314A（VWD檢測器）,。 ● G1362A（示差檢測器）,。 ● G131/B （DAD檢測器）。 ● G1321A （FLD檢測器）,。 ● 色譜柱: Zorbax eclipse XDB C8,150mm×4.6mm i.d。 2,、溶劑準備： ● 色譜級純或優(yōu)級純乙腈（ACN）或甲醇。 ● 二次蒸餾水 基本操作步驟: （一）、開機： 1,、打開計算機,進入Windows NT （或Windows 2000）畫面,并運行Bootp Server程序。 2,、打開 1100 LC 各模塊電源,。 3、待各模塊自檢完成后,，雙擊Instrument 1 Online圖標,，化學工作站自動與1100LC通訊，進入的工作站畫面如下所示,。 4,、從“View”菜單中選擇“Method and Run control”畫面, 單擊”View”菜單中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”,，“System diagram”,”Sampling diagram”,，使其命令前有“√”標志，來調用所需的界面,。 5,、把流動相放入溶劑瓶中。 6,、打開Purge閥,。 7、單擊Pump圖標,，出現參數設定菜單,，單擊Setup pump選項，進入泵編輯畫面,。 8 ,、設Flow：5ml/min，單擊OK,。 9,、單擊Pump圖標，出現參數設定菜單,，單擊Pump control選項,，選中On，單擊OK,，則系統(tǒng)開始Purge,，直到管線內（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止,切換通道繼續(xù)Purge，直到所有要用通道無氣泡為止,。 10,、單擊Pump圖標,，出現參數設定菜單，單擊Pump Control選項,，選中Off,，單擊Ok關泵，關閉 Purge valve,。 11,、單擊Pump圖標，出現參數設定菜單,，單擊Setup pump選項,，進入Pump編輯畫面，設Flow：1.0ml/min,。 12,、單擊泵下面的瓶圖標，如圖所示（以二元泵為例）,，輸入溶劑的實際體積和瓶體積,。也可輸入停泵的體積。單擊Ok,。 （二）數據采集方法編輯： 1,、開始編輯完整方法： ● 從“Method”菜單中選擇“Edit entire method” 項，如上圖所示選中除“Data analysis ”外的三項,，單擊Ok,，進入下一畫面。 2,、方法信息： ● 在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）,。 ● 單擊Ok 進入下一畫面。 3,、泵參數設定：（以二元泵為例） ● 在“Flow”處輸入流量,如1ml/min,，在“Solvent B”處輸入70.0,（A=100-B） ,也可Insert 一行”Timetable” ,編輯梯度。在“Pressure Limits Max”處輸入柱子的zui大耐高壓,，以保護柱子,。 ● 單擊Ok進入下一畫面。 4,、自動進樣器參數設定: ● 選擇合適的進樣方式, 如圖所示，進樣體積 1.0ul ,洗瓶位置為6號,。“Standard Injection”----只能輸入進樣體積,，此方式無洗針功能。“Injection with Needle Wash”----可以輸入進樣體積和洗瓶位置,，此方式針從樣品瓶抽完樣品后,，會在洗瓶中洗針,。“Use injector program”---可以點擊Edit 鍵進行進樣程序編輯。 ● 點擊Ok進入下一畫面,。 5,、柱溫箱參數設定: ● 在”Temperature”下面的方框內輸入所需溫度,并選中它,點擊”more>>” 鍵,如圖所示,選中”Same as left”---使柱溫箱的溫度左右一致。 ● 點擊ok進入下一畫面,。 6,、VWD檢測器參數設定: ● 在”Wavelength”下方的空白處輸入所需的檢測波長,如254nm, 在”Peak width （Response time）”下方點擊下拉式三角框,選擇合適的響應時間, 如>0.1min （2s）。 ● 在Timetable 中可以“Insert”一行,，輸入隨時間切換的波長,，如1min ，波長=300nm,。點擊ok進入下一畫面,。 7、DAD檢測器參數設定: ● 檢測波長: 254nm,BW=30nm, 參比波長=350nm,BW=100nm; ● 檢測波長：一般選擇zui大吸收處的波長,。樣品帶寬BW：一般選擇zui大吸收值一半處的整個寬度,。參比波長：一般選擇在靠近樣品信號的無吸收或低吸收區(qū)域。參比帶寬BW：至少要與樣品信號的帶寬相等,，許多情況下用100nm作為缺省值,。Peak width（Response time）：其值盡可能接近要測的窄峰峰寬。Slit—狹縫窄,，光譜分辨率高,；寬時，噪音低,。同時可以輸入采集光譜方式,，步長，范圍,，閾值,。選中所用的燈。 ● 點擊Ok進入下一畫面,。 8,、 RID檢測器參數設定: ● 色譜條件: 進樣體積: 20ul。 光學單元溫度: Off ,。 極性: 正,。 峰寬（響應時間） : 4s 。 ● 如圖所示: “Optical Unit Temperature”---若環(huán)境溫度控制在±2℃,設定為Off, 若環(huán)境溫度不穩(wěn)定,則設定光學單元溫度為高于環(huán)境溫度5度,以防樣品在池中沉淀,。“Peak width”---大多數分析設為4S,，只有在高速分析下設為更短。“Automatic recycling after analysis”---在不進行分析時可以讓流動相循環(huán)，節(jié)省流動相,，檢測器連續(xù)運行,，可隨時投入使用。 ● ***** 點擊RID圖標,，選擇RID Control ：Heater 設為On,，若要循環(huán)流動相，必須將“Recycling Valve”設為ON,。手動purge 參比池,，將其設為On，并輸入Purge 時間,。 9,、 FLD檢測器參數設定: 色譜條件： ● 樣品：P/N 01018-68704 用甲醇稀釋為1:10。 ● 進樣體積：5ul,。 ● 柱溫箱: 30℃,。 EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。 ● 響應時間=4s. 停止時間：出峰完畢,。 ● Excitation A: 激發(fā)波長:200-700nm,步長為1nm,或Zero Order,。 ● Emission: 發(fā)射波長: 280-900nm, 步長為1nm,或Zero Order。 ● PMT: 大多數應用適當的設定值為10,若高濃度樣品峰被切平頭,則減少 PMT 值,。 ● “Peak width”：大多數應用設為4s,，只有快速分析采用小的設定值。 ● Multi Ex ：多波長及光譜（激發(fā)）,。 ● Multi Em：多波長及光譜（發(fā)射）,。 ● 同時可以輸入范圍Range、步長step,、采集光譜,。 10、在“ Run time checklist ”中選中“Data acquisition”,，單擊Ok,。 11、單擊“Method”菜單,，選中“Save method as”,，輸入一方法名，如“test”,，單擊Ok,。 12、從菜單 “View”中選中”Online signal” ,選中Windows 1,然后單擊Change 鈕,將所要繪圖的信號移到右邊的框中,點擊Ok.（如同時檢測二個信號,則重復12,選中 Windows 2）,。 13,、從“Run control ”菜單中選擇“Sample info”選項,，如上圖所示，輸入操作者名稱,，在“Data file ”中選擇“Manual”或“Prefix”。 區(qū)別: Manual--每次做樣之前必須給出新名字,否則儀器會將上次的數據覆蓋掉,。 Prefix—在Prefix 框中輸入前綴,，在Counter 框中輸入計數器的起始位，儀器會自動命名,，如vwd0001,，vwd0002……。 14,、從Instrument 菜單選擇System on,。 15、等儀器Ready,，基線平穩(wěn),，從Method菜單中選擇“Run method”，進樣,。（DAD, VWD色譜圖如下所示：） （三）,、數據分析方法編輯: 1、從“View”菜單中,，單擊“Data analysis”進入數據分析畫面,。 2、從“File”菜單選擇“Load signal”,，選中您的數據文件名,，如下圖所示。單擊Ok,。 3,、做譜圖優(yōu)化,從“Graphics”菜單中選擇“Signal options”選項，,。從Ranges中選擇Auto scale及合適的顯示時間,，單擊ok,或選擇”Use Ranges” 調整。反復進行,，直到圖的比例合適為止,。 4、積分: （1）,、從“Integration”中選擇 “Auto integrate”,如積分結果不理想,再從菜單中選擇“Integration Events”選項,，選擇合適的Slope sensitivity，Peak width,，Area reject,，Height reject,。 （2）、從“Integration”菜單中選擇“Integrate”選項,，則數據被積分,。 （3）、如積分結果不理想,，則修改相應的積分參數,，直到滿意為止。 （4）,、單擊左邊“√”圖標,，將積分參數存入方法。 5,、打印報告: （1）,、從“Report”菜單中選擇“Specify report”選項，進入如上畫面,。 （2）,、單擊“Quantitative Results”框中Calculate右側的黑三角，選中Percent（面積百分比）,，其它選項不變,。 （3）、單擊Ok. （4）,、從“Report”菜單中選擇“Print report”,，則報告結果將打印到屏幕上，如想輸出到打印機上,，則單擊Report 底部的“Print”鈕,。 （四）、關機: ● 關機前,，用 100%的水沖洗系統(tǒng)20分鐘,，然后用有機溶劑沖洗系統(tǒng)10分鐘（如ACN），然后關泵,，（適于反相色譜柱）,。[正相色譜柱用適當的溶劑沖洗] ● 退出化學工作站，及其它窗口,，關閉計算機（用shut down關）,。 ● 關掉Agilent 1100電源開關。 （五）,、Agilent 1100 LC維護保養(yǎng)： 1,、色譜柱長時間不用，存放時,，柱內應充滿溶劑,，兩端封死（如ACN適于反相色譜柱,，正相色譜柱用相應的有機相） 2、對于手動進樣器,，當使用緩沖溶液時,，要用水沖洗進樣口，同時搬動進樣閥數次,，每次數毫升,。 *3、流動相使用前必須過濾,，不要使用多日存放的蒸餾水（易長菌）。 *4,、帶seal-wash的 1100,，要配制90%水+10%異丙醇，以每分2—3滴的速度虹吸排出,，溶劑不能干涸,。 5、其它主意事項見說明書,，或由現場工程師介紹,。 維護知識問答 1、為什么溶劑和樣品要過濾? 溶劑和樣品過濾非常重要,，它會對色譜柱,、儀器起到保護作用，消除由于污染對分析結果的影響,。 色譜柱：由于填料顆粒很細,，色譜柱內腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使色譜柱和毛細管容易堵塞,。 儀器：溶劑和樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損,，同時也會增加泵頭內的藍寶石活塞桿和活塞的磨損。 樣品過濾頭的類型： 30mm內徑：適用于大進樣量的過濾,，由0.2μm和0.45μm兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯,。處理樣品體積少于50μl。 13mm內徑：適用于范圍廣的過濾,，由0.2μm和0.45μm兩種規(guī)格,材料為纖維素,。 3mm內徑：適用于小進樣量的過濾，由0.2μm和0.45μm兩種規(guī)格,。處理樣品體積為7μl,。 濾膜類型： 聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽,，并無任何可溶物,。 醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑,，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質和其相關樣品,。 尼龍66濾膜：適用于絕大多數有機溶劑和水溶液,，可用于強酸，70%乙醇,、二氯甲烷,、不適用于二甲基甲酰胺。 再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低,，同樣適用水溶性樣品和有機溶劑,。 2、為什么HPLC用緩沖鹽時要加在線Seal-wash選項,？ HPLC用緩沖鹽時,由于泵頭內的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現象,析出的細小鹽粒非常堅硬,它附著在藍寶石活塞桿上,隨著藍寶石活塞桿的往復運動,容易產生劃痕,并磨損密封墊,造成漏液等故障現象,。在線Seal-wash選項能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結晶。緩沖鹽的濃度在0.1mol或大于0.1mol時,必須使用該在線沖洗選項. 清洗液配制: 90%水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類生長和減小水的表面張力,。以2-3滴/min的速度虹吸流下,，不能干涸。 3,、為什么Agilent 1100LC的流動相管路非常細? 在使用HPLC時,應特別注意”柱外效應”對分析結果的影響,，由于樣品分子在液體流動相中的擴散系數比在氣體中小4~5個數量級，液體流動相的流速也比氣相慢1-2個數量級,。因此,，樣品進入色譜柱后，在柱子以外的任何死體積（進樣器,、柱接頭,、連接管、檢測器）中,，樣品分子的擴散和滯留,，都會引起色譜峰的展寬，而使柱效降低,。為使柱外效應減之zui小,，獲得理想的分析結果，Agilent 1100LC 使用加工工藝難度高的毛細管線作為流動相管路,。 毛細管線分類：0.17mm內徑 ------綠色 ;0.12mm內徑-------紅色,。 PEEK 管線：內徑 -----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。 毛細管線優(yōu)點: 柔韌性好. ***Agilent 公司同時備有1/16in 的粗外徑毛細管線,適用于不同習慣的用戶 ,優(yōu)點是剛性好,但柔韌性差一些,。 4,、流動相使用前為什么要脫氣？ 流動相使用前必須進行脫氣處理,，以除去其中溶解的氣體（如O2）,，以防止在洗脫過程中當流動相由色譜柱流至檢測器時,，因壓力降低而產生氣泡。氣泡會增加基線的噪音,，造成靈敏度下降,，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導致樣品中某些組份被氧化,，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能,。若用FLD，可能會造成熒光猝滅,。 常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低,，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好,，但成本高,。 加熱回流法：效果較好，但操作復雜,，且有毒性揮發(fā)污染。 抽真空脫氣法：易抽走有機相,。 超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中,，用超聲波振蕩10-15min，此法效果zui差,。 在線真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機利用膜滲透技術,，在線脫氣，智能控制,，無需額外操作,，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法,，并適用于多元溶劑體系,。 5、如何防止溶劑瓶內溶劑過濾器的堵塞,，以及堵塞后的處理,？ 溶劑的質量或污染以及藻類的生長會堵塞溶劑過濾器，從而影響泵的運行,，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液（PH=4—7）,。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶內溶劑過濾器的堵塞。 A：請嚴格執(zhí)行溶劑過濾,。 B：請勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液 C：如果應用許可,，可在溶劑中加入0.0001---0.001M的*. D:在溶劑瓶內溶劑的上方小流量連續(xù)吹氬氣,以隔絕空氣。 E：避免使溶劑瓶暴露在直射陽光下,，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液,。 堵塞后的處理法方法： 將過濾頭從組件中取下,，在濃硝酸（35%）中浸泡1h，然后用二次蒸餾水沖洗干凈并超聲處理,。 6,、 Agilent 1100LC泵如何維護？ Agilent 1100LC泵給色譜柱提供穩(wěn)定,、無脈動,、流量準確的流動相，及時合理的維護非常重要,。 A：流動相使用前請必須脫氣,、過濾。 B：使用緩沖鹽時,，要加在線Seal-wash選項,。 C：關機前，用 100%的水沖洗系統(tǒng)20分鐘,，然后用有機溶劑沖洗系統(tǒng)10分鐘（如甲醇）,，然后關泵，（適于反相色譜柱）,。[正相色譜柱用適當的溶劑沖洗] D：及時更換Purge Valve內的過濾芯,。（當打開Purge Valve時，壓力高于10bar,，表明過濾芯已堵）,。E：使用合適的密封圈。 7,、如何選擇合適的泵頭活塞密封圈,？ 泵頭活塞的標準密封圈能適合于大多數應用，但使用正相溶劑（如正己烷）,，不適合使用標準活塞密封圈,，特別是長時間使用時，需更換另一種不同的密封圈,，我們建議使用聚四氟乙烯密封圈,。（p/n0905-1420 2/pk） ***注意：聚四氟乙烯密封圈的壓力范圍為：0—200bar；建議在泵的壓力限制中,，將zui大壓力設為200bar,。 8、使用梯度比例發(fā)時要注意那些事項,？ 當鹽溶液與有機溶劑溶液混合時,，鹽溶液能與有機溶劑溶液*混溶，而不會出現沉淀。但是在比例閥的混合點,，重力作用使鹽顆粒沉淀下來,，通常，閥A接水相/鹽溶液,，D接有機溶劑,，此法連接可有效使鹽回落到鹽溶液中，并被溶解,。若顛倒過來,，鹽可能落在有機溶劑中，出現問題,。強烈建議：當使用緩沖鹽溶液和有機溶劑時,，推薦將緩沖鹽通道接在A通道上，有機溶劑通道直接接在A通道的上方D通道上,；定期用水沖洗所有的通道,，以除去閥口上可能出現的鹽沉淀。 9,、在線真空脫氣機使用要注意那些事項,？ 一般來說，Agilent 1100LC 的真空脫氣機無需過多維護,，只需注意幾個注意事項就可以了,。 A：*次使用，要用隨儀器附帶的注射器抽滿脫氣機腔體,；更換不同類型的溶劑時，要先抽空,，再抽滿,。 B：不用的通道要充滿溶劑或密閉起來。 10,、更換色譜柱時要注意什么事項? 在使用HPLC時,應特別注意”柱外效應”對分析結果的影響,，由于樣品分子在液體流動相中的擴散系數比在氣體中小4~5個數量級，液體流動相的流速也比氣相慢1-2個數量級,。因此,，樣品進入色譜柱后，在柱子以外的任何死體積（進樣器,、柱接頭,、連接管、檢測器）中,，樣品分子的擴散和滯留,，都會引起色譜峰的展寬，而使柱效降低,。為使柱外效應減之zui小,，獲得理想的分析結果,，儀器的流動相管路連接非常重要,一般Agilent 1100LC 在*次安裝時,均有受過專業(yè)培訓的安裝工程師負責安裝,各種接頭會處理的非常?？蛻糁恍柙诟鼡Q色譜柱時注意接頭處理就可以了,，一般柱子入口接頭為不銹鋼卡套接頭，柱子出口為不銹鋼卡套接頭或PEEK管線手擰街頭,，當完成*次安張后,，不銹鋼卡套已固定死，當接不同的柱子時,，要注意柱子接頭處的形狀和長度,，否則會產生一個非常大的死體積。 下面是不同廠家柱子接頭的形狀和長度,，請參考： 11,、手動進樣閥需做那些維護，使用時要注意什么,？ 對于手動進樣器,，當使用緩沖溶液后，或者進濃度差異比較大的樣品時要用工具而不是用帶針頭的注射器沖洗進樣口,，同時搬動進樣閥數次,，每次數毫升。 注意事項： ● 安裝時六通閥的5,，6出口要與注射器在同一水平線上,，以防止虹吸現象的發(fā)生，導致進樣量的重復性變異,。 ● 進樣量的多少要根據定量管的LOOP體積決定,。 當樣品量少時：進樣體積由注射器的進樣體積決定，但zui大進樣體積要小于1/2loop體積,。 當樣品量較多時：進樣體積由定量管的體積決定,，為保證樣品*把定量管的流動相置換干凈，需注射5—6倍的LOOP體積,。 ● C：要使用的液相注射器進樣,，不可以用氣相的注射器。 |
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