使用說(shuō)明書

檢測(cè)原理

試劑盒采用雙抗原一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)

先包被人抗AECA抗原的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、HRP標(biāo)記的檢測(cè)

抗原，經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過(guò)氧化物酶的

催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。用酶標(biāo)儀

在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值）,，與CUTOFF值相比較，從而判

定標(biāo)本中人抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體（AECA）的存在與否,。

樣品收集,、處理及保存方法

1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞

刺激,，收集血液后,，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地

分離。

2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清,。

3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。

4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘

取上清,。

5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝,，凍存于

-20℃,，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

自備物品

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

操作注意事項(xiàng)

1. 試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20 分鐘。從冰箱取出的

濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解

后再使用,。

2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存。3. 預(yù)處理后的樣本無(wú)需稀釋,，直接取50μL 加樣即可,。

4. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作,。

5. 所有液體組分使用前充分搖勻,。

試劑盒組成

名稱96孔配置48孔配置備注

微孔酶標(biāo)板12 孔×8 條12 孔×4 條無(wú)

陰性對(duì)照0.5mL 0.5mL 無(wú)

陽(yáng)性對(duì)照0.5mL 0.5mL 無(wú)

檢測(cè)抗原-HRP 10mL 5mL 無(wú)

20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋

底物A 6mL 3mL 無(wú)

底物B 6mL 3mL 無(wú)

終止液6mL 3mL 無(wú)

封板膜2 張2 張無(wú)

說(shuō)明書1 份1 份無(wú)

自封袋1 個(gè)1 個(gè)無(wú)

試劑的準(zhǔn)備

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20 稀釋，即1 份的20×洗滌緩

沖液加19 份的蒸餾水,。

洗板方法

1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，靜置1min 后甩盡

孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干,，如此洗板5 次。

2. 自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min，洗板5 次,。

操作步驟

1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封

袋密封放回4℃。

2. 設(shè)置陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔,，陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、

陽(yáng)性對(duì)照各50μL,；

3. 待測(cè)樣本孔加待測(cè)樣本50μL,；

4. 隨后陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）

標(biāo)記的檢測(cè)抗原100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫

箱溫育60min。

5. 棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液，靜置1min,，甩去

洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5 次（也可用洗板機(jī)洗板）,。

6. 每孔加入底物A,、B 各50μL，37℃避光孵育15min,。7. 每孔加入終止液50μL,，15min 內(nèi)，在450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的

OD 值,。

結(jié)果判斷

1. 試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD 值平均值≥1.00,；

陰性對(duì)照孔OD 值平均值≤0.15。

2. 臨界值（Cut off）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15

3. 陰性判斷：樣品OD 值＜臨界值（Cut off）,，樣品為陰性

4. 陽(yáng)性判斷：樣品OD 值＞臨界值（Cut off）,，樣品為陽(yáng)性

試劑盒性能

1. 準(zhǔn)確性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD 值平均值≥1.00；陰性對(duì)照孔OD 值平均

值≤0.15,，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果有效,。

2. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

3. 重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%,。

4. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存,。

5. 有效期：6 個(gè)月

免責(zé)聲明

1. 試劑盒僅供研究使用,，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn)，否則所

產(chǎn)生的一切后果,，由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān),，本公司概不負(fù)責(zé)。

2. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，實(shí)驗(yàn)者違反說(shuō)明書操作,，后果由實(shí)驗(yàn)者

承擔(dān),。