（一） 原理

目前用于抗體標(biāo)記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocynate,FITC）或羅達(dá)明（Lis

samine rhodamine B200, RB200）,。在鹼性條件下 FITC 的碳酰胺鍵可與抗體賴(lài)氨酸的ε氨基共價(jià)結(jié)合,，標(biāo)

記后的抗體仍保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力,。在熒光燈源紫外線(xiàn)或蘭紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過(guò)在熒

光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性,、定位或定量的檢測(cè),。

（二） 操作步驟

將純化的 IgG 抗體對(duì) PH9～9.5 碳酸鹽緩沖液透析過(guò)夜，

透析后抗體液移入小燒杯中

↓

稱(chēng)取適量 IFTC,，加入二甲亞砜（DMSO）（FITC～1mg/1ml DMSO） 使終濃度為 1mgFITC／1mlDMSO

FITC／IgG 比例:如 IgG 濃度為 1mg／ml,，F(xiàn)ITC／IgG 比例約為 50μgFITC／mgIgG；

如 IgG 為 5～10mg／ml,，則比例為 25μgFITC／ml IgG 在 10ml 小燒杯中先放入抗體

↓

按上述比例將 FITC-DMSO 溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中

↓

將標(biāo)記物用 PBS 加至 2.5ml,，磁力攪拌器室溫下避光攪拌 2h ↓

用 PD10 柱（Sephadex G25 柱）除去游離熒光素，先用 25ml PBS 淋洗 G25 柱

↓

收集 PBS 洗脫*個(gè)熒光素結(jié)合蛋白峰,，測(cè)定 F／P 比值,。第二個(gè)熒光素峰為游離熒光素

計(jì)算:

2.87×A495

F／P＝────────

A280-0.35×A495 合適的 F／P 值為 2～4。

（三） 試劑器材

1. 純化的多克隆抗體或單克隆抗體,。

2. FITC（Fluorescein-5-Lsothiocyanalte）或其它熒光色素,。

3. PBS、DMSO4. PH9～9.5 碳酸鹽緩沖液: Na2CO34.3g,，NaHCO3 8.6g 加蒸餾水至 500ml,。

5. PD10 柱（Sephadex G25 柱）

6. 磁力攪拌器，紫外分光光度計(jì)等

（四） 注意事項(xiàng)

1. FITC 保存于 4℃暗處,，使用前待試劑瓶升至室溫時(shí)開(kāi)蓋稱(chēng)取,，以避免潮解。

2. FITC-DMSO 液要臨用時(shí)配制,。

3. 碳酸鹽緩沖液要新鮮配制,。