準備：

培養(yǎng)基A：RPMI1640 + 2mmol/L 谷氨酰胺+ 1mmol/L丙酮酸鈉+ 1 mmol/L非必需氨基酸+青霉素100U/ml, 鏈霉素100 µg/ml（有的實驗室也加入10%NCTC109 培養(yǎng)基）

培養(yǎng)基B：培養(yǎng)基A +3% FCS （見后說明）

培養(yǎng)基C：培養(yǎng)基A + 1× HAT + 20% FCS（500ml）

50 × HAT液或粉劑（有商品）

PEG1500 （有商品,，可即用）

1mol/L硫酸銅液

17mol/L NH4Cl 水溶液（消毒,，用于紅細胞溶解）

培養(yǎng)皿（直徑100或60mm）

細胞粗濾器（篩孔：40 µm ）

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骨髓瘤細胞必須培養(yǎng)至少一周，要求在融合日要達到對數生長期,。所有的實驗操作均需在消毒條件下進行,。

脾細胞制備

1．分離取出脾臟，置于含7ml培養(yǎng)基B的培養(yǎng)皿中（在動物房進行）,，將培養(yǎng)皿移入垂直氣流的通風櫥中,；

2．將脾臟移入另一含7ml培養(yǎng)基A的培養(yǎng)皿中，用鑷子撕開脾臟,，使大多數脾細胞釋出,；

3．用吸管吹打細胞團塊，將混合液移入50ml聚丙乙烯管中,，4℃沉降5min,；

4．將細胞懸液移入另一50ml聚丙乙烯管， 200 × g 離心7min,，棄上清,；

5．用冰冷的0.17mol/L NH4Cl 水溶液（2-3ml/ 每個脾臟）懸起沉淀，在室溫下培養(yǎng)5-10 min,，以溶解紅細胞,，然后緩慢加入45ml培養(yǎng)基A；

6．200 × g 離心7min,，棄上清,；

7．沉淀再懸入10ml 培養(yǎng)基A中。

骨髓瘤細胞的制備

1．在對數生長期收獲107-108的骨髓瘤細胞,；

2．200 × g 離心7min,，棄上清,；

3．輕輕震動試管以松動沉淀，將細胞懸于20ml 培養(yǎng)基A中,；

4．200 × g 離心7min,，棄上清；

5．細胞懸于10 ml 培養(yǎng)基A中,，取適量進行細胞計數,；

6．200 × g 離心7min，棄上清,；

7．沉淀再懸于10 ml 培養(yǎng)基A中,。

通過細胞融合得到B細胞雜交瘤

1．以2：1混合脾細胞與骨髓瘤細胞；

2．加入培養(yǎng)基A到25ml,；

3．在室溫下,，200 × g 離心7min，棄上清,；

4．輕輕震動試管使松動沉淀,，后置入37℃水浴,；

5．用1000µl的加樣器,，緩慢（超過1min）逐滴加入700µl經37℃預溫的PEG1500，并用吸頭攪拌,；

6．經過1 min后,，緩慢（超過3min）加入5ml培養(yǎng)基A；

7．再過1 min ,，加入7ml 37℃預溫的培養(yǎng)基A,；

8．隔1 min，再加入7ml 37℃預溫的培養(yǎng)基A（以達逐步稀釋）,；

9．室溫下,，200 × g 離心10min，棄上清,；

10．再將沉淀小心地懸浮于培養(yǎng)基C,，使細胞終濃度為1 × 106 脾細胞/ml；

11．在已加100 µl培養(yǎng)基C/孔的2-3塊96孔板中,，再加入100 µl/ 孔細胞懸液,；

12．置入含5-8%CO2的37℃培養(yǎng)箱中；

13．一周后,，每孔吸出100 µl上清,，再加入100 µl培養(yǎng)基C，繼續(xù)每周換液1-2次；

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