（二）細(xì)胞融合
1．細(xì)胞融合前準(zhǔn)備
（1）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：
骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高,，也便于接種雜
交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb,。
（2）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖,，若
加入其它活細(xì)胞,，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)
細(xì)胞,。在制備McAb 的過程中,，許多環(huán)節(jié) 需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩
選,、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中,，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：
小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）,、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞,。也有人用小鼠成纖
維細(xì)胞系3T3 經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2×104 或
105 細(xì)胞/孔。
2．細(xì)胞融合的步驟
（1）制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,。
與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C 小鼠,，6～10 周
↓
拉頸 處死,，浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min
↓
用無菌剪刀剪開皮膚,，暴露腹膜
↓
用無菌注射器注入5～6ml 預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管）
↓
反復(fù)沖洗,，吸出沖洗液
↓
沖洗液放入10ml 離心管，1200rpm/分離5～6min
↓
用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸,，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至
1×105/ml
↓
加入96 孔板,，100μl/孔
↓
放入37℃ CO2 孵箱培養(yǎng)
（2）制備免疫脾細(xì)胞
zui后一次加強(qiáng)免疫3 天后小鼠拉頸處死
↓
無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次
↓
脾臟研碎,，過細(xì)胞篩
↓
離心,，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2 次
↓
計(jì)數(shù)
↓
取108 脾淋巴細(xì)胞懸液備用
（3）制備骨髓瘤細(xì)胞
取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心
↓
用無血清培養(yǎng)液洗2 次
↓
計(jì)數(shù)，取得×107 細(xì)胞備用
（4）融合
①將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10 或1：5 的比例混合在一起,，在50ml 離心
管中用無血清不*培養(yǎng)液洗1 次,，離心，1200rpm,8min;棄上清,，用吸管吸凈
殘留液體,，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底,，使細(xì)胞沉淀略
松動,。
②90s 內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖
動,。37℃水浴作用90s,。
③加37℃預(yù)溫的不*培養(yǎng)液以終止PEG 作用，每隔2min 分別加入1ml,、
2ml,、3ml、4ml,、5ml 和6ml,。
④離心，800rpm, 6min,。
⑤充上清,，用含20%小牛血清HAT 選擇培養(yǎng)液重懸。
⑥將上述細(xì)胞,，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96 孔板內(nèi),，每孔加100μl。一般一
個(gè)免疫脾臟可接種4 塊96 孔板。
⑦將培養(yǎng)板置37℃,、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。
（三）選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測
1．HAT 選擇雜交瘤細(xì)胞
脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG 處理后，形成多種細(xì)胞的混合體,，只有脾細(xì)胞與
骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義,。在HAT 選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，由于骨髓瘤
細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶,，故不能生長繁殖,，而雜交瘤細(xì)
胞具有上述兩種酶，在HAT 選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖,。
在用HAT 選擇培養(yǎng)1～2 天內(nèi),，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3～4 天后瘤細(xì)胞消失,，
雜交細(xì)胞形成小集落,，HAT 選擇培養(yǎng)液維持7～10 天后應(yīng)換用HT 培養(yǎng)液，再維
持2 周,，改用一般培養(yǎng)液,。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10 面
積時(shí),，即可開始檢測特異性抗體,，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期
間,，一般每2～3 天換一半培養(yǎng)液,。
2．抗體的檢測
檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同,，選擇不同的篩選方法,，
一般以快速、簡便,、特異,、敏感的方法為原則。
常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原,、細(xì)胞McAb
的檢測,。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等McAb
的檢測,。（3）免疫熒光試驗(yàn)適合于細(xì)胞表面抗原的McAb 的檢測,。（4）其它如間
接血凝試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn),、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗(yàn)等,。
（四）雜交瘤的克隆化
雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化,。因?yàn)榻?jīng)過HAT 篩選后的雜
交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中,，可能會有數(shù)個(gè)甚至更
多的克隆,，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞,、所需要的抗體（特異性抗
體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞,。要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要克隆
化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化,，否則抗體
分泌的細(xì)胞會被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制,，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長速度比抗
體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細(xì)胞丟失,。即使克隆
化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆,，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，
從而喪失產(chǎn)生抗體的能力,。
克隆化的方法很多,，zui常用的是有限稀釋法
有限稀釋法克隆
（1）克隆前1 天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。
（2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干,，計(jì)數(shù),。
（3）調(diào)整細(xì)胞為3～10 個(gè)細(xì)胞/ml。
（4）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板,，每孔加入稀釋細(xì)胞100μl,。
孵育于37℃、5%CO2 孵箱中 ,。
（5）在第7 天換液,，以后每2～3 天換液1 次。
（6）8～9 天可見 細(xì)胞克隆形成,，及時(shí)檢測抗體活性,。
（7）將陽性孔的細(xì)胞移至24 孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。
（8）每個(gè)克隆應(yīng)盡快凍存,。
（五）雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
1．雜交瘤細(xì)胞的凍存
細(xì)胞凍存液：50%小牛血清,；40%不*培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）,。
凍存液預(yù)冷,，操作動作輕柔、迅速,。凍存時(shí)從室溫可立即降至0℃后放
入-70℃超低溫冰箱,，次日轉(zhuǎn)入液氮中,。
2．細(xì)胞復(fù)蘇方法 將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中,，在1min
內(nèi)使凍存的細(xì)胞解凍,，將細(xì)胞用*培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的
飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi),，置37℃,、5%CO2 孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞形成集落時(shí),，檢測
抗體活性,。
（六）單克隆抗體的大量生產(chǎn)
大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：
（1）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從一清液中獲取單克隆抗
體,。但此方法產(chǎn)量低,，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產(chǎn)，
費(fèi)用較高,。
（2）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞,，制備腹水或血清。
①實(shí)體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107/ml 接種于小鼠背部皮
下,，每處注射0.2ml,共2～4 點(diǎn),。待腫瘤達(dá)到一定大小后（一般10～20 天）則
可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達(dá)到1～10mg/ml,。但采血量有限,。
②腹水的制備：常規(guī)是先腹腔注射0.5ml Pristane （降植烷）或液體石蠟于
BALB/C 鼠，1～2 周后腹腔注射1×106 個(gè)雜交瘤細(xì)胞,，接種細(xì)胞7～10 天后可產(chǎn)
生腹水,。

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