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上海滬峰是一家專業(yè)經(jīng)營生物、儀器,、試劑耗材的公司,，在廣大用戶的幫助和支持下,，經(jīng)過不懈的努力,，已成為國內(nèi)生命科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)品的主要供應(yīng)商之一,，代理許多*水平的高科技產(chǎn)品,，包括分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué),、免疫學(xué),、診斷等多個(gè)研究及應(yīng)用領(lǐng)域。公司的服務(wù)和業(yè)務(wù)網(wǎng)絡(luò)遍及全國,，在同行獲得*,。
要一次進(jìn)行這么多種反應(yīng)，我們當(dāng)然不想在反應(yīng)中缺了哪個(gè)組分,。一般多重PCR需要更多的dNTP,、鎂離子和聚合酶。Nichols推薦使用0.3 mM dNTP（而非標(biāo)準(zhǔn)的0.2 mM）,、2.5 mM Mg2+（而非1.2至2 mM）以及每50μL反應(yīng)體系5 units聚合酶（而非1.25 units）,。zui后再試試鹽濃度，“在優(yōu)化的時(shí)候,，增加鹽總會(huì)有幫助,，尤其能增加特異性。”
PCR master mix含有緩沖液,、鹽,、dNTP、Mg和聚合酶,，如果我們使用常規(guī)1.25× 或1.5×的PCR master mix就已經(jīng)差不多做到了上述原則的三至五,。另外，您還可以選用轉(zhuǎn)為多重PCR優(yōu)化的產(chǎn)品,，例如NEB的多重PCR 5× Master Mix,、Bio-Rad的iQ™ Multiplex Powermix、或者安捷倫的Brilliant Multiplex QPCR Master Mix,。
據(jù)安捷倫的Mason介紹，Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是經(jīng)過專門設(shè)計(jì)的,，能夠很好的解決同一管中不同反應(yīng)相互競爭的問題,。如果一個(gè)目標(biāo)片段出現(xiàn)1000次，而另一個(gè)目標(biāo)片段只出現(xiàn)了10次,，那么后一個(gè)片段就很容易淪為背景,。“我們的多重PCR試劑盒能夠在同一個(gè)管中準(zhǔn)確定量低豐度和高風(fēng)度的目標(biāo)片段，克服偏向性,，”Mason說,。
據(jù)安捷倫的Mason介紹，Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是經(jīng)過專門設(shè)計(jì)的,，能夠很好的解決同一管中不同反應(yīng)相互競爭的問題,。如果一個(gè)目標(biāo)片段出現(xiàn)1000次，而另一個(gè)目標(biāo)片段只出現(xiàn)了10次,，那么后一個(gè)片段就很容易淪為背景,。“我們的多重PCR試劑盒能夠在同一個(gè)管中準(zhǔn)確定量低豐度和高風(fēng)度的目標(biāo)片段，克服偏向性,，”Mason說,。
我能擴(kuò)多少目標(biāo)片段一般來說，zui多能在同一個(gè)管中同時(shí)檢測(cè)到五個(gè)目標(biāo)片段，這既是出于引物設(shè)計(jì)的考慮,，也是由多重定量PCR的硬件條件決定的,。實(shí)時(shí)熒光PCR儀通常zui多檢測(cè)4至5個(gè)顏色通道，其中一個(gè)可能還要留作參考通道,。凝膠電泳雖然不受此限制,，但多引物一同作用仍然存在困難，因此還是zui多達(dá)到五重PCR,。 “設(shè)計(jì)更多是挑戰(zhàn)性的,，”Cockrum說。
多重定量PCR的染料能進(jìn)行多重定量PCR的儀器包括：Life Tech公司的QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System,、安捷倫公司的Mx30005P等等,。目前zui流行的選擇是HEX、FAM和VIC,，而FAM/HEX和FAM/VIC是用的zui普遍的,。Life Tech除了生產(chǎn)VIC外，近期又發(fā)布了兩個(gè)新染料ABY和JUN以及一個(gè)新passive reference dye——Mustang Purple,。
多重定量PCR的染料能進(jìn)行多重定量PCR的儀器包括：Life Tech公司的QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System,、安捷倫公司的Mx30005P等等,。目前zui流行的選擇是HEX、FAM和VIC,，而FAM/HEX和FAM/VIC是用的zui普遍的,。Life Tech除了生產(chǎn)VIC外，近期又發(fā)布了兩個(gè)新染料ABY和JUN以及一個(gè)新passive reference dye——Mustang Purple,。
Cockrum建議將染料強(qiáng)度與模板豐度結(jié)合起來,，用zui亮的染料（通常是FAM）配zui少的模板，用zui黯淡的染料（例如Cy5或Quasar 705）配豐度zui高的模板（如看家基因）,。
更多重的PCR當(dāng)然,，引物設(shè)計(jì)是多重PCR的zui大障礙，不過一旦克服了這一障礙我們就能進(jìn)行更多重的PCR反應(yīng),。安捷倫的MassCode技術(shù)就能夠超越定量PCR儀帶來的硬件限制,，安捷倫公司將這一技術(shù)推薦給那些想要同時(shí)篩選十個(gè)以上目標(biāo)片段的用戶，例如可以用來檢測(cè)病原體,。
更多重的PCR當(dāng)然,，引物設(shè)計(jì)是多重PCR的zui大障礙，不過一旦克服了這一障礙我們就能進(jìn)行更多重的PCR反應(yīng),。安捷倫的MassCode技術(shù)就能夠超越定量PCR儀帶來的硬件限制,，安捷倫公司將這一技術(shù)推薦給那些想要同時(shí)篩選十個(gè)以上目標(biāo)片段的用戶，例如可以用來檢測(cè)病原體,。
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