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大鼠核轉(zhuǎn)錄因子（NF-kB ）ELISA試劑盒
原理
本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 NF-kB單抗包被于酶標板上,，標準品和樣品中的 NF-kB與單抗結(jié)合,，加入生物素化的抗大鼠NF-kB ，形成免疫復合物連接在板上,，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，zui后加終止液硫酸,，在450nm處測OD值，NF-kB 濃度與OD值成正比,，可通過繪制標準曲線求出標本中NF-kB 濃度,。
試劑盒組成（2-8℃保存）
| 酶標板（Coated Wells） | 96孔 | 酶標抗體工作液（Enzyme Conjugate） | 12ml |
| 10×標本稀釋液（Sample Buffer） | 12ml | 20×濃縮洗滌液（Wash Buffer） | 50ml |
| 標準品（Standards）：10ng/瓶 | 2瓶 | 底物工作液（TMB Solution） | 12ml |
| *抗體工作液（Biotinylated Antibody） | 12ml | 終止液（Stop Solution） | 12ml |
準備試劑與收集血樣
1. 收集標本：血清、血漿（EDTA）,、細胞培養(yǎng)上清液,、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時,；更長時間須冷凍（-20℃或-70℃）保存,，避免反復凍融。
2. 標準品液配制：使用前加入0.5ml蒸餾水混勻,，配成20ng/ml的溶液,。設(shè)標準管8管，*管加標本稀釋液900ul,，第二至第八管加入標本稀釋液500ul,。在*管中加入20ng/ml的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管,。如此反復作對倍稀釋,，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照,。
3. 10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）,。
4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）
標本激活方法
1. 將450ul標本稀釋液加入到一支1.5ml進口聚丙烯管中,再加10ul血清或血漿標本。
2. 加20ul 1 N HCI,蓋緊,，上下混勻,。2－8℃放置60± 2分鐘。
3. 加20ul 1 N NaOH,蓋緊,，上下混勻,。
4. 即用，或放-20/-70℃保存3天。計算結(jié)果時乘以稀釋倍數(shù)50,。（注意：不同的標本NF-kB 的水平可能有較大差異,，請根據(jù)實際情況靈活掌握稀釋度）
5. 細胞培養(yǎng)上清或組織勻漿10倍稀釋（410ul的標本稀釋液＋50ul樣本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH）。
檢測程序
1. 加樣：每孔各加入標準品或待測樣品（已激活）100ul,，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘,。
2. 洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干,。
3. 每孔中加入*抗體工作液100ul,。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。
4. 洗板：同前,。
5. 每孔加酶標抗體工作液100ul,。將反應板置37℃30分鐘。
6. 洗板：同前,。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應15分鐘,。
8. 每孔加入100ul終止液混勻,。
9. 30分鐘內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值。
結(jié)果計算與判斷
1. 所有OD值都應減除空白值后再行計算,。
2. 以標準品2000,、1000、500,、250,、125、62.5,、31.2,、0 pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標,，在坐標紙上作圖,，畫出標準曲線。
3. 根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應NF-kB 含量,，再乘上稀釋倍數(shù)即可,。
試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的NF-kB檢測濃度小于15pg/ml。
2. 特異性：可同時檢測重組或天然的大鼠NF-kB ,。不與大鼠其它細胞因子有交叉反應,。
3. 重復性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于8.9％,。
注意事項
1. 以上標準孔及待測樣品均建議做復孔,，每次測定應同時做標準曲線。
2. 洗滌過程很關(guān)鍵,。洗滌不充分將導致度誤差及OD值錯誤地升高,。
3. 板條開封后剩余板條要再封好,，保持板條干燥。
4. 本試劑盒宜置4oC冰箱保存,。
5. 本試劑盒僅用于科研,，不能用于臨床診斷！
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