大鼠核轉(zhuǎn)錄因子p65(NF-kB p65)ELISA試劑盒
原理
本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法,。用抗大鼠 NF-kB p65單抗包被于酶標板上,,標準品和樣品中的 NF-kB p65與單抗結(jié)合,,加入生物素化的抗大鼠NF-kB p65,形成免疫復合物連接在板上,,辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合,,加入底物工作液顯藍色,zui后加終止液硫酸,,在450nm處測OD值,,NF-kB p65濃度與OD值成正比,可通過繪制標準曲線求出標本中NF-kB p65濃度,。
試劑盒組成(2-8℃保存)
酶標板(Coated Wells) | 96孔 | 酶標抗體工作液(Enzyme Conjugate) | 12ml |
10×標本稀釋液(Sample Buffer) | 12ml | 20×濃縮洗滌液(Wash Buffer) | 50ml |
標準品(Standards):20ng/瓶 | 2瓶 | 底物工作液(TMB Solution) | 12ml |
*抗體工作液(Biotinylated Antibody) | 12ml | 終止液(Stop Solution) | 12ml |
準備試劑與收集血樣
1. 收集標本:血清,、血漿(EDTA)、細胞培養(yǎng)上清液,、組織勻漿等盡早檢測,,2-8℃保存48小時;更長時間須冷凍(-20℃或-70℃)保存,,避免反復凍融,。
2. 標準品液配制:使用前加入1ml蒸餾水混勻,配成20ng/ml的溶液,。設標準管8管,,*管加標本稀釋液900ul,第二至第八管加入標本稀釋液500ul,。在*管中加入20ng/ml的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul,,移至第二管。如此反復作對倍稀釋,,從第七管中吸出500ul棄去,。第八管為空白對照。
3. 10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋(示例:1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水),。
4. 洗滌液:用重蒸水1:20稀釋(示例:1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水)
標本激活方法
1. 將450ul標本稀釋液加入到一支1.5ml進口聚丙烯管中,再加10ul血清或血漿標本,。
2. 加20ul 1 N HCI,蓋緊,上下混勻,。2-8℃放置60± 2分鐘,。
3. 加20ul 1 N NaOH,蓋緊,上下混勻,。
4. 即用,,或放-20/-70℃保存3天。計算結(jié)果時乘以稀釋倍數(shù)50,。(注意:不同的標本NF-kB p65的水平可能有較大差異,,請根據(jù)實際情況靈活掌握稀釋度)
5. 細胞培養(yǎng)上清或組織勻漿10倍稀釋(410ul的標本稀釋液+50ul樣本+20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。
檢測程序
1. 加樣:每孔各加入標準品或待測樣品(已激活)100ul,,將反應板充分混勻后置37℃120分鐘,。
2. 洗板:用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次,,向濾紙上印干。
3. 每孔中加入*抗體工作液100ul,。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘,。
4. 洗板:同前。
5. 每孔加酶標抗體工作液100ul,。將反應板置37℃30分鐘,。
6. 洗板:同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul,,置37℃暗處反應15分鐘,。
8. 每孔加入100ul終止液混勻。
9. 30分鐘內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值,。
結(jié)果計算與判斷
1. 所有OD值都應減除空白值后再行計算,。
2. 以標準品2000、1000,、500、250,、125,、62.5、31.2,、0 pg/ml為橫坐標,,OD值為縱坐標,在坐標紙上作圖,,畫出標準曲線,。
3. 根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應NF-kB p65含量,再乘上稀釋倍數(shù)即可,。
試劑盒性能
1. 靈敏度:zui小的NF-kB p65檢測濃度小于15pg/ml,。
2. 特異性:可同時檢測重組或天然的大鼠NF-kB p65。不與大鼠其它細胞因子有交叉反應,。
3. 重復性:板內(nèi),、板見變異系數(shù)均小于8.9%。
注意事項
1. 以上標準孔及待測樣品均建議做復孔,,每次測定應同時做標準曲線,。
2. 洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致度誤差及OD值錯誤地升高,。
3. 板條開封后剩余板條要再封好,,保持板條干燥。
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