產(chǎn)品編號(hào)： EIA06235
使用前*閱讀說(shuō)明書(shū),。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于經(jīng)典酶聯(lián)夾心技術(shù)原理，能測(cè)量大鼠Insulin,，只能用于研究用途,，不得用于醫(yī)學(xué)診斷。

工作原理
Insulin,，胰島素,。胰島素由A、B兩個(gè)肽鏈組成,。胰島素（Insulin Human）A鏈有11種21個(gè)氨基酸,，B鏈有15種30個(gè)氨基酸，共16種51個(gè)氨基酸組成。其中A7（Cys）-B7（Cys）,、A20（Cys）-B19（Cys）四個(gè)半胱氨酸中的巰基形成兩個(gè)二硫鍵,，使A、B兩鏈連接起來(lái),。此外A鏈中A6（Cys）與A11（Cys）之間也存在一個(gè)二硫鍵,。胰島素是一種蛋白質(zhì)類(lèi)激素,體內(nèi)胰島素是由胰島β細(xì)胞分泌的。在胰腺中散布著許許多多的細(xì)胞群,，叫做胰島,。胰島素是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖,、核糖,、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素,。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（ELISA）,。預(yù)先包被的抗體為多克隆抗體。檢測(cè)相抗體也為多克隆抗體,，經(jīng)生物素（biotin）標(biāo)記,。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS或TBS洗滌,。隨后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；經(jīng)過(guò)PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測(cè)因子呈正相關(guān),。

每套試劑盒中內(nèi)容（96T）
材料 數(shù)量
標(biāo)準(zhǔn)品 96T（2vial）
預(yù)包被抗體的96孔板 96T（8×12）
生物素標(biāo)記抗體 96T （1:100）
ABC（親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物） 96T （1:100）
樣品稀釋液 96T×2
抗體稀釋液 96T×1
ABC稀釋液 96T×1
TMB顯色液A 96T×1
TMB顯色液B 96T×1
TMB終止液 96T×1
ELISA洗滌液 96T×1（1:25）

需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱,。
2． 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
3． 自動(dòng)洗板機(jī),。
4． 單通道或多通道可調(diào)節(jié)移液器以及其吸頭,。
5． 蒸餾水，容量瓶等
6． 干凈的試管和Eppendof管,。

注意事項(xiàng)
1． 從-20℃取出的試劑盒,，在4℃解凍過(guò)夜。盒內(nèi)每一瓶解凍的溶液在開(kāi)啟瓶蓋之前都要輕輕搖勻,，避免解凍時(shí)出現(xiàn)的分層,，否則會(huì)出現(xiàn)濃度不均一的現(xiàn)象。
2． 開(kāi)啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘,。
3． 配制各種試劑時(shí),，切記混勻！
4． 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到管底,。
5． 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本都做雙份檢測(cè),。
6． 要嚴(yán)格避免操作過(guò)程中酶標(biāo)板干燥,。干燥會(huì)使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活！
7． 為免交叉污染,，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,。

樣品的準(zhǔn)備和保存
樣品如果不立即分析，應(yīng)分裝后冷凍保存,，且避免反復(fù)凍融,。
血清——用干凈試管收集血液，室溫凝固2小時(shí)或4℃過(guò)夜,，離心1000×g 10分鐘,，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存,。
細(xì)胞培養(yǎng),、組織勻漿、體液——離心去除沉淀,，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存,。

樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱文獻(xiàn)了解標(biāo)本內(nèi)待測(cè)因子的含量，決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù),，以使稀釋后樣品中待測(cè)因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測(cè)范圍,。樣品的稀釋?xiě)?yīng)有詳細(xì)記錄。

試劑的準(zhǔn)備和保存
A. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和使用：在使用前2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備,。將凍干品管內(nèi)加入1ml樣品稀釋液,，*溶解后做倍比稀釋。
稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品在2小時(shí)內(nèi)使用,。

B．生物素標(biāo)記抗體工作液：在使用前2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備,。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計(jì)算總的用量（實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul生物素標(biāo)記抗體加抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻,。

C．親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）工作液的準(zhǔn)備：在使用前1小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備,。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計(jì)算總的用量（實(shí)配時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液,。輕輕混勻,。

D. TMB顯色工作液的準(zhǔn)備：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比例配制TMB顯色工作液,。

操作程序
1． 確定本次檢測(cè)所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目,。
2． 將倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為對(duì)照,。處理后的標(biāo)本按100ul每孔加入,。
3． 酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)90分鐘,。
4． 反應(yīng)后用自動(dòng)洗板機(jī)吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；或甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，再對(duì)著吸水紙拍幾下,。洗滌2次,。
5． 將準(zhǔn)備好的生物素抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)60分鐘,。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次,，每次浸泡1分鐘左右。
7． 將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入,。37℃反應(yīng)30分鐘,。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右,。
9． 按每孔0.1ml依次加入TMB顯色工作液，37℃避光反應(yīng),，反應(yīng)過(guò)程中,，要經(jīng)常的觀察，當(dāng)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,，后3-4孔差別不明顯時(shí),，即可加入TMB終止液0.1ml/孔。（顯色反應(yīng)zui長(zhǎng)不要超過(guò)30分鐘）,。
10． 用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定O.D.值,。
11． 根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對(duì)應(yīng)的濃度。用戶也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算,。應(yīng)記住由于樣品稀釋了N倍,，其實(shí)際濃度應(yīng)該×N。

操作程序總結(jié)：
準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,，37℃反應(yīng)90分鐘

洗板2次,，加入生物素化抗體工作液，37℃反應(yīng)60分鐘

洗板3次,，加入ABC工作液,，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板5次，加入TMB顯色液,，37℃反應(yīng)

加入TMB終止液

30分鐘之內(nèi)讀OD值

計(jì)算標(biāo)本待測(cè)因子含量

檢測(cè)范圍：100mIU/ml→1.56mIU/ml,。
敏感性： ＜0.3mIU/ml
特異性： 系統(tǒng)和其它因子無(wú)交叉反應(yīng)。
保存： -20℃ [短期內(nèi)（如兩周）可4℃]
有效期： 12個(gè)月（-20℃）,。
用途： 用于體外定量分析液體標(biāo)本（通用型）,。

REFERENCES
1. Nature 284:26-32（1980）.
2. Science 209:612-615（1980）.
3. Nature 282:525-527（1979）.
4. Science 208:57-59（1980）.
5. Nat. Genet. 4:305-310（1993）.
6. Genome Res. 13:2101-2111（2003）.
7. Genome Res. 14:2121-2127（2004）.
8. Nature 187:483-485（1960）.
9. Chem. Ber. 106:188-192（1973）.
10. Chem. Ber. 106:199-205（1973）.
11. J. Clin. Invest. 78:1666-1672（1986）