實(shí)驗(yàn)用途：

蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot ）可以：

（1）從蛋白質(zhì)混合物中檢出目標(biāo)蛋白質(zhì)；

（2）定量或定性確定細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況,；

（3）用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì),、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析,。

實(shí)驗(yàn)原理：

Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法。對已知表達(dá)蛋白,，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測,，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測,。

與Southern或Northern雜交方法類似,，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì),，“探針”是抗體,，“顯色”用標(biāo)記的二抗。

經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上,，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變,。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá),。

實(shí)驗(yàn)材料：

蛋白質(zhì)樣品 

試劑,、試劑盒：

丙烯酰胺 SDS  Tris-HCl β-巰基乙醇 ddH2O 甘氨酸 Tris 甲醇 PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考馬斯亮蘭 乙酸 脫脂奶粉 硫酸鎳胺 H2O2 DAB試劑盒 

儀器、耗材：

電泳儀 電泳槽 離心機(jī) 離心管 

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、試劑準(zhǔn)備

1.SDS-PAGE試劑：見聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn),。

2.勻漿緩沖液：1.0 M Tris-HCl（pH 6.8） 1.0 ml,；10%SDS 6.0 ml；β-巰基乙醇 0.2 ml,；ddH2O 2.8 ml,。

3.轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g,；SDS 0.37 g,；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml,。

4.0.01 M PBS（pH7.4）：NaCl 8.0 g,；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g,；KH2PO4 0.24 g,；加ddH2O至1000 ml。

5.膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2 g,；甲醇80 ml,；乙酸2 ml；ddH2O118 ml,。包被液（5%脫脂奶粉,，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。

6.顯色液：DAB 6.0 mg,；0.01 M PBS 10.0 ml,；硫酸鎳胺 0.1 ml；H202 1.0 μl,。

二,、蛋白樣品制備

1. 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取

（1）倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）,。

（2）每瓶細(xì)胞加3 ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）,。平放輕輕搖動1 min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液,。重復(fù)以上操作兩次,，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上,。

（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM）,，搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合,。）

（4）每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液,，于冰上裂解30 min,，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。

（5）裂解完后,，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快）,，然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行,。）

（6）于4℃下12000 rpm離心5 min,。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）

（7）將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于－20℃保存。

2. 組織中總蛋白的提取

（1）將少量組織塊置于1～2 ml勻漿器中球狀部位,，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎,。

（2）加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿,。然后置于冰上,。

（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎,。

（4）裂解30 min后,，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中，然后在4℃下12000 rpm離心5 min,，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存,。

3. 加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取

由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來,，所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞,。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取：

（1）將培養(yǎng)液倒至15 ml離心管中,，于2500 rpm離心5 min,。

（2）棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌,，然后2500 rpm離心5 min,。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。

（3）用槍洗干上清后,，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min,，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。

（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃,、12000 rpm離心5 min,，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。

三,、蛋白含量的測定

1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1）從－20℃取出1 mg/ml BSA,，室溫融化后，備用,。

（2）取18個1.5 ml離心管,，3個一組,，分別標(biāo)記為0 mg，2.5 mg,，5.0 mg，10.0 mg,，20.0 mg,，40.0 mg。

（3）按下表在各管中加入各種試劑,。

（4）混勻后,，室溫放置2 min。在生物分光光度計（Bio-Photometer,，Eppendorf）上比色分析,。

2. 檢測樣品蛋白含量

（1）取足量的1.5 ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml,。室溫放置30 min后即可用于測蛋白,。

（2）取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品,，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品,。

（3）棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL）,，再用無菌水洗一次,。

（4）取一管考馬斯亮藍(lán)加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待測蛋白樣品，混勻后靜置2 min,，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品,。

注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次,?？赏瑫r混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時間,。測得的結(jié)果是5 ml樣品含的蛋白量,。

四、SDS－PAGE電泳

1. 清洗玻璃板

一只手扣緊玻璃板,，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗,。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干,。

2. 灌膠與上樣

（1）玻璃板對齊后放入夾中卡緊,。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊,，以免漏膠,。）

（2）按前面方法配10%分離膠,，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時,，可用10 ml槍吸取5 ml膠沿玻璃放出,，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水,，液封后的膠凝的更快,。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度,。操作時膠一定要沿玻璃板流下,，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢,，否則膠會被沖變型,。）

（3）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了,。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干,。

（4）按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中,。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生,。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小,，從而使加樣孔的上樣體積減小,，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后,，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出,。

（5）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中,。（小玻璃板面向內(nèi),，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠,，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外,。）

（6）測完蛋白含量后，計算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量,。取出上樣樣品至0.5 ml離心管中,，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15 μl,，加樣孔的zui大限度可加20 μl樣品,。）上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。

（7）加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣,。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板,。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品,，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品,。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔,，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時,，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次,，以免交叉污染。

3. 電泳

電泳時間一般4～5 h,，電壓為40 V較好，也可用60 V,。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

五,、轉(zhuǎn)膜

1. 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3 cm的濾紙和1張7.3～8.6 cm的硝酸纖維素膜,。切濾紙和膜時一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜廴灸?。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用,。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上,，只有下層才與水接觸,。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水里,，膜與水之間形成一層空氣膜,，這樣會阻止膜吸水。

2. 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子,、兩塊海綿墊,、一支玻棒、濾紙和浸過的膜,。

3. 將夾子打開使黑的一面保持水平,。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡,。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動,。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡,。

4. 要先將玻璃板撬掉才可剝膠,，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬,。撬一會兒玻璃板便開始松動,，直到撬去玻板,。（撬時一定要小心，玻板很易裂,。）除去小玻璃板后,，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破,。小心剝下分離膠蓋于濾紙上,，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡,。將膜蓋于膠上,，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡,。zui后蓋上另一個海綿墊,，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行,，要不斷的搟去氣泡,。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路,。（轉(zhuǎn)移液含甲醇,，操作時要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通,。）

5. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中,，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面,。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱,，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h,。

6. 轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）,。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用,。

六,、免疫反應(yīng)

1. 將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中,，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h,。

2. 將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5 ml離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺面上,，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整,；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后,，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上,，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2 h后,，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,，每次10 min；再用TBS洗一次,，10 min,。

3.同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2 h后,，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次,，每次10 min；再用TBS洗一次,，10 min,，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

七,、化學(xué)發(fā)光，顯影,，定影

1. 將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合,；1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸,；1 min后,，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液,，包好,，放入X-光片夾中。

2. 在暗室中,，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中,；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大1 cm）,；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上,，一旦放上,，便不能移動，關(guān)上X-光片夾,，開始計時,；根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間，一般為1 min或5 min，也可選擇不同時間多次壓片,，以達(dá)*效果,；曝光完成后，打開X-光片夾,，取出X-光片,，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后,，即刻終止顯影,。顯影時間一般為1～2 min（20～25℃），溫度過低時（低于16℃）需適當(dāng)延長顯影時間,；顯影結(jié)束后,，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為5～10 min,，以膠片透明為止,；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干,。

應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動膠片時,，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片,，否則會對結(jié)果產(chǎn)生影響,。

八、凝膠圖象分析

將膠片進(jìn)行掃描或拍照,，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值,。展開 

注意事項：

1、一抗,、二抗的稀釋度,、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定*條件。

2,、顯色液必須新鮮配置使用,，zui后加入H2O2。

3,、DAB有致癌的潛在可能,，操作時要小心仔細(xì)。

其他：

免疫反應(yīng)：

1. 用0.01 M PBS洗膜,，5 min ×3次,。

2. 加入包被液，平穩(wěn)搖動,，室溫2 h,。

3. 棄包被液，用0.01 M PBS洗膜，5 min×3次,。

4. 加入一抗（按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋,，液體必須覆蓋膜的全部），4℃ 放置12 h以上,。陰性對照,，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同,。

5. 棄一抗和1%BSA,，用0.01 M PBS分別洗膜，5 min×4次,。

6. 加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01 M  PBS稀釋）,，平穩(wěn)搖動，室溫2 h,。

7. 棄二抗,，用0.01 M PBS洗膜，5 min×4次,。

8. 加入顯色液,，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。