KPL二抗

來源：北京欣興唐生物科技有限公司 2012年11月27日 17:51

二抗

二抗在免疫學(xué)實驗中起著舉足輕重的作用,，二抗的選擇也決定了整個實驗的成敗。實驗中在選擇二抗時必須注意以下幾點：

（1）一抗種屬來源

主要根據(jù)一抗種屬來源來決定確定二抗的類型,，如一抗是小鼠來源,，那二抗就買抗小鼠的即可（如羊抗小鼠、兔抗小鼠等均可）,。

（2）一抗類型

二抗需與一抗的類別或亞類相匹配,。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白,，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體.

單克隆抗體的類別及亞類通常會在產(chǎn)品說明書中都會有描述,，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgM。

如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1,，IgG2a,，IgG2b，IgG3）,，那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合,，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如,，如果你的一抗是小鼠IgG1,，那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標(biāo)記實驗中尤其適合,。

在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下,，可以選用抗相應(yīng)物種IgG。

（3）標(biāo)記物的選擇

一般來講,，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,，PAP），熒光基團（FITC, RRX, TR, PE）和生物素,。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗,。對于western blot和ELISA，zui常用的二抗是酶標(biāo)二抗,，而細(xì)胞或組織標(biāo)記實驗（細(xì)胞免疫化學(xué),，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團標(biāo)記的二抗,，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗,。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用biotin/avidin檢測系統(tǒng),。

下面簡單介紹幾種二抗探針的優(yōu)缺點及其適用的實驗：

a. 酶：
主要有兩種不同的酶耦聯(lián)物,，HRP和AP。比較而言,，前者更經(jīng)濟,、快速、穩(wěn)定,，而后者較前者更為靈敏,，通常情況下，HRP廣泛應(yīng)用于免疫組化,，western blot和ELISA中,，而堿性磷酸酶（AP）更適合于固相的免疫檢測實驗，如ELISA和western blot.

b. 熒光基團：
FITC：FITC是廣泛使用的熒光基團,，但其zui大的缺點是淬滅快,，使用抗淬滅劑可以減輕,。
AMCA：常用在多標(biāo)記實驗中，如免疫熒光,、流式細(xì)胞術(shù),。其缺點是，淬滅快,，且由于肉眼不能很好的檢測其所激發(fā)的藍(lán)色熒光,，因而AMCA耦聯(lián)的二抗更適用于檢測大量存在的抗原。
花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更穩(wěn)定,，且在表面熒光顯微鏡下,，Cy2的熒光FITC更強。Cy3和Cy5比大多數(shù)熒光基團更亮,，更穩(wěn)定,，背景更弱。二者常在共聚焦顯微實驗中作多標(biāo)記,。但Cy5的缺點是不能用表面熒光顯微鏡觀察,，因此通常用具有遠(yuǎn)紅外檢測器的共聚焦顯微鏡觀察。
TRITC,RRX,TR:TRITC經(jīng)常和FITC一起用于雙標(biāo)記實驗中,，也可以使用RRX或TR,，但TR會產(chǎn)生較高

的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標(biāo)記實驗時,，RRX尤其有用,，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因為RRX的發(fā)射波長在Cy2和Cy5中間,，且和這兩者的重疊很少,。
PE：常和FITC一起用于流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)記實驗。

注：由于觀察熒光需要一定波長的激發(fā)光,，必須根據(jù)實驗室已有的儀器可發(fā)光的波段進(jìn)行選擇,。

熒光素根據(jù)其發(fā)射波長可分為：

<499nm，藍(lán)色熒光（Blue）

500-549nm,，綠色熒光（Green）

550-584nm,，黃色熒光（Yellow）

585-615nm，橙色熒光（Orange）

616-700nm,，紅色熒光（Red）

>=700nm,，遠(yuǎn)紅外熒光（Far-Red）

幾種新型熒光基團

熒光基團	顏色	激發(fā)光波長（nm）	發(fā)射光波長（nm）
DyLight 488		493	518
DyLight 549		550	568
DyLight 649		646	674
DyLight 680	Near Red	682	715
DyLight 800	Infrared	770	794

n 熒光亮度更強

n 發(fā)光更持久適合于熒光拍照

n 靈敏度更高

n 高信噪比、低背景

n 穩(wěn)定性更好適用于pH4～9的各種緩沖系統(tǒng)中

c. 生物素：
生物素（biotin）可以和抗生素蛋白/鏈酶親和素（avidin/streptavidin）發(fā)生不可逆反應(yīng)而緊密結(jié)合在一起,。首先加入生物素標(biāo)記的二抗，在加入耦聯(lián)有酶或熒光集團的avidin或streptavidin,，后者能夠結(jié)合于二抗表面的多個位點上,，從而極大的放大檢測信號,。

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