一,、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />　　
　　掌握人類外周血細(xì)胞培養(yǎng)方法及染色體標(biāo)本的制備方法,。觀察人類染色體的形態(tài)和數(shù)目,。
　　
　　二、實(shí)驗(yàn)原理
　　
　　血液中的T淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)中經(jīng)一定劑量的植物血凝素（PHA）刺激,，可以返幼進(jìn)行細(xì)胞分裂,，用秋水仙素積累分裂相，用0.075mol/L-1KCI進(jìn)行低滲后,，經(jīng)固定,、染色，可見(jiàn)到分散的染色體,。
　　
　　三,、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
　　
　　超凈工作臺(tái)、紅外線滅菌器（艾本森儀器公司）,、無(wú)菌注射器（1ml,、2ml、5m1）,、針頭,、培養(yǎng)瓶、橡皮塞,、75％酒精棉球,、離心機(jī),、定時(shí)鐘、試管架,、量筒、刻度離心管,、冰涼玻片,，毛細(xì)滴管、恒溫水浴鍋,、RPMI1640,、小牛血清、肝素,、秋水仙素,、植物血凝素（PHA）、固定液（甲醇：冰乙酸為3∶1,，現(xiàn)用現(xiàn)配）,、0.075mol。L-1KCI低滲液,、Giemsa染液,、pH6.8磷酸緩沖液、恒溫培養(yǎng)箱,、吹風(fēng)機(jī),、粗天平、5％NaHCO3,、顯微鏡,。
　　
　　四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟
　　
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　　取500單位/lml的肝素0,。2ml濕潤(rùn)針筒后，取靜脈血1～2ml,，轉(zhuǎn)動(dòng)針筒以混勻肝素,；隨后立即插入滅菌小瓶?jī)?nèi)，送入超凈工作臺(tái)（消毒,、滅菌等略）,，在紅外線滅菌器旁將血液滴入2～3個(gè)盛有5ml培養(yǎng)液（4mlRPMIl640、lml小牛血清,，5mgPHA,，用5％的NaHCO3調(diào)pH至7.0～7.4）的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶0.2～0.3ml（7號(hào)針頭13滴）,，蓋上橡皮塞,，輕輕搖動(dòng)以混勻。
　　
　　（二）培養(yǎng)
　　
　　1．將培養(yǎng)瓶放在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72h,。
　　
　　2．在終止培養(yǎng)前2～4h,，將0.01％的秋水仙素1～2滴（7號(hào)針頭）加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，輕輕搖勻．放回溫箱內(nèi),，繼續(xù)培養(yǎng)2～4h,。
　　
　　（三）收獲
　　
　　1．用吸管充分吹打瓶壁,，吸取培養(yǎng)物移入刻度離心管內(nèi),，相對(duì)離心管平衡后放入離心機(jī)，離心8min（1000轉(zhuǎn)/分）,，吸去上清液,，留下沉淀物。
　　
　　2．低滲處理：加8ml預(yù)溫（370C）的0.075mol,。L-1KCI低滲液,，用吸管打勻使細(xì)胞懸
　　
　　浮于低滲液中，放回37℃恒溫水浴鍋中,，靜置15～20min,，使白細(xì)胞膨脹，染色體分散,、
　　
　　紅細(xì)胞解體,。
　　
　　3．預(yù)固定：加入固定液1～2ml打勻。
　　
　　4．再離心：1000轉(zhuǎn)/分離心8min,，吸去上清液,，留下沉淀物。
　　
　　5．固定：沿離心管壁加入新配固定液8ml打勻,，固定30min,。
　　
　　6．再離心：1000轉(zhuǎn)/分離心8min，棄去上清液,，留下沉淀物,。
　　
　　7．再固定：再加入新配固定液8ml，打勻,，靜置30min,。
　　
　　8．再離心：1000轉(zhuǎn)/分離心8min，棄去上清液,。
　　
　　9．第四次固定：加入新配固定液0.5～lml打勻成細(xì)胞懸液,。
　　
　　10．制片：用滴管吸細(xì)胞懸液2～3滴，滴在冰水預(yù)浸泡的潔凈載玻片上,，立即用口吹散,，在酒精燈上過(guò)幾次,，吹風(fēng)機(jī)吹干或氣干。
　　
　　11．染色：Giemsa染液（原液∶pH6.8磷酸緩沖液為1∶9）染色10min～20min,、自來(lái)水沖洗,、晾干。
　　
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　　低倍鏡下找到分散良好的分裂相后,，換高倍鏡、油鏡,、認(rèn)真觀察。
　　
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　　1．PHA是體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵問(wèn)題,，因此，要考慮它的質(zhì)量和濃度,。鹽水提取物一般冰凍保存的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),，時(shí)間長(zhǎng)了效價(jià)減低。
　　
　　2．濃度一般用1％～2％,，每毫升培養(yǎng)液加0.2～0.4ml,；濃度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集。
　　
　　3．秋水仙素溶液濃度和處理時(shí)間,。一般zui終濃度每毫升培養(yǎng)液0.1～0.2μg為宜,，作用時(shí)間為3～5h，一般秋水仙素溶液的濃度與處理時(shí)間有一定的關(guān)系,。如果處理時(shí)間太短,，則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞就少，相反,，如果處理時(shí)間太長(zhǎng),，則標(biāo)本中的分裂細(xì)胞雖多，但其染色體縮得太短,，以致形態(tài)特征模糊,。
　　
　　4．培養(yǎng)溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在37℃+0.5℃。
　　
　　5．雙蒸水必須用玻璃蒸餾器制備,，pH應(yīng)在6～7之間,。
　　
　　6．低滲步驟極為重要，關(guān)系到染色體分散的好壞,，因此,，低滲液濃度與低滲的時(shí)間應(yīng)掌握適當(dāng)。
　　
　　7．離心機(jī)用水平式的,，速度不宜過(guò)快,。速度太快細(xì)胞團(tuán)不易打散,，反之分裂相易丟失；固定液應(yīng)在臨用時(shí)新鮮配制,，固定一定要*,、均勻。若打散不夠,，則細(xì)胞在玻片上易集結(jié),。
　　
　　8．若吹打時(shí)用力過(guò)猛，細(xì)胞易破碎,，以致染色體數(shù)目不完整,；培養(yǎng)液的pH值應(yīng)掌握在7.4土0.1左右，pH值偏酸發(fā)育不良,，偏堿時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)輕度固縮,。
　　
　　9．玻璃器皿都要十分干凈、無(wú)酸,，所用試劑以分析純?yōu)楹谩?br />　　
　　10．操作過(guò)程應(yīng)保持高度無(wú)菌概念,，嚴(yán)防細(xì)菌和病毒污染；在外周血培養(yǎng)中,，PHA對(duì)淋巴細(xì)胞的作用,，個(gè)體差異較大。同樣方法和條件,，分裂相多少及分散情況不一樣,。因此，若失敗,，應(yīng)充分考慮到這些因素,。
　　
　　（五）預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
　　
　　將制作好的片子在油鏡下仔細(xì)觀察,，選擇較好的分裂相進(jìn)行照相,、剪貼、分組,，將照片上的核型進(jìn)行剪貼,，寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)報(bào)告與實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　
　　染色體數(shù)目為46XX,，（XY）為人類正常核型,。若某對(duì)染色體少了一條（2n-1），細(xì)胞染色體數(shù)目為45,；或某一對(duì)染色體多了一條（2n+1）,，細(xì)胞染色體數(shù)目為47；若為兩種核型,，46,，XX/46,，XXY稱為嵌合體。以上三種為異常核型,。
　　
　　艾本森的生產(chǎn)的紅外線滅菌器已經(jīng)在各個(gè)實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用,，為各個(gè)實(shí)驗(yàn)的成功提供了有力的保障。請(qǐng)大家認(rèn)準(zhǔn)ABSON品牌的紅外線滅菌器,。