（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />　　
　　1．掌握FISH技術(shù)的一般原理,，及其基本實(shí)驗(yàn)方法,；
　　
　　2．了解FISH技術(shù)的發(fā)展概況，以及應(yīng)用范圍,。
　　
　?。ǘ?shí)驗(yàn)原理
　　
　　FISH是以分子雜交為基礎(chǔ)，應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)標(biāo)記核酸探針,，通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理與靶DNA雜交,，在核中或染色體上顯示靶DNA序列位置的方法,。FISH技術(shù)可分為四個(gè)步驟：樣品制備、探針標(biāo)記,、雜交及其檢測(cè),。
　　
　　（三）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
　　
　　1．材料染色體標(biāo)本或血涂片
　　
　　2．試劑甲醇,、乙醇,、乙酸、標(biāo)記探針（生物素標(biāo)記探針或地高辛標(biāo)記探針）,、3mol/L乙酸鈉,、甲酰胺（分子生物學(xué)級(jí)和粗制品）、雜交緩沖液（4×SSC,，20%硫酸葡萄糖）,、鮭精DNA、磷酸鈉,、Tween20,、BSA、檢測(cè)液（5μg/ml熒光素偶聯(lián)的親和素或6μg/ml羅丹明偶聯(lián)的抗地高辛抗體）DAPI
　　
　　3．儀器低溫高速離心機(jī),、熒光顯微鏡,、MixPlus旋渦混合器、移液器,、恒溫水浴鍋,、培養(yǎng)箱、烤箱
　　
　?。ㄋ模?shí)驗(yàn)方法與步驟
　　
　　1．探針混合與變性
　　
　?。?）混合20～60ng標(biāo)記探針DNA和3～5μg鮭精DNA。反應(yīng)后體積少于10μl,，可直接凍干,；若體積較大，可加1/20體積的3mol/L乙酸鈉和2倍體積100%乙醇沉淀DNA,?；靹虿⒂?70℃30min。在4℃,，12000r/min離心10min,，棄上清，沉淀物以300μl70%乙醇洗滌后在離心（同上）,，棄上清,，凍干。
　　
　　（2）將DNA重懸于5μl去離子的甲酰胺中,，室溫旋渦混勻3min,。
　　
　　（3）加入5μl雜交緩沖液,，,MixPlus旋渦混合器中混勻5min,。
　　
　　（4）將DNA探針置于75℃水浴中變性5min,。迅速置于冰浴中5min,，備用。
　　
　　2．樣本處理
　　
　?。?）染色體制備標(biāo)本或血涂片在室溫下依次用70%,、90%、100%的乙醇脫水,，各5min,。涼干備用。
　　
　?。?）變性前將載玻片置60℃烤箱內(nèi)孵育,，目的是防止變性液加至載玻片時(shí)溫度降低。
　　
　?。?）將變性液在水浴箱中加熱至70℃,。
　　
　　（4）將預(yù)熱的載玻片移至含變性液（70%去離子甲酰胺,、2×SSC和50mmol/L磷酸鈉）的Coplin廣口瓶?jī)?nèi)2min,。
　　
　　（5）立即將載玻片依次移入70%,、90%和100%預(yù)冷的乙醇中,，各5min。防止DNA復(fù)性,。
　　
　　（6）空氣干燥,。
　　
　　3．雜交
　　
　?。?）將10μl含變性探針的雜交混合液加至載玻片上變性的靶DNA上。
　　
　?。?）在雜交液上蓋上蓋玻片,，防止產(chǎn)生氣泡。
　　
　?。?）用橡膠泥將蓋玻片四周封好,，并置濕盒內(nèi)37℃溫浴過(guò)夜。
　　
　　4．檢測(cè)
　　
　　（1）從濕盒內(nèi)取出載玻片,，除去橡膠泥,。
　　
　　（2）將載玻片置于42℃預(yù)溫的漂洗液A（50%甲酰胺,，2×SSC）中,，在恒溫水浴搖床中振蕩10min，并使蓋玻片脫落,。更換漂洗液A兩次,，每次振蕩5min。
　　
　?。?）將載玻片移入60℃預(yù)溫的漂洗液B（1×SSC～0.1×SSC,，pH7.0，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整,。）,，漂洗5min，更換漂洗液B兩次,，每次5min,。
　　
　　（4）將載玻片取出,，甩盡液體,，加200μl封閉液（3%BSA，4×SSC,，0.1％Tween20）,，蓋上蓋玻片，防止氣泡產(chǎn)生,，置于濕盒內(nèi),，37℃溫浴30min以上。
　　
　?。?）移去蓋玻片,，除去多余液體，加200μl檢測(cè)液（5μg/ml熒光素偶聯(lián)的親和素或6μg/ml羅丹明偶聯(lián)的抗地高辛抗體,，緩沖液為1%BSA,、4×SSC和0.1Tween20），在37℃濕盒內(nèi)溫浴30min,。
　　
　?。?）移去蓋玻片，將載玻片置于漂洗液C（4×SSC,，0.1％Tween20,，pH7.0）中，42℃振蕩漂洗3次，各5min,。
　　
　?。?）將載玻片置于復(fù)染液（2×SSC，200ng/mlDAPI）中,，室溫振蕩20min,。
　　
　　（8）載玻片在漂洗液D（2×SSC,，0.05%Tween20）中室溫溫育1min～2min,。
　　
　　（9）熒光顯微鏡下觀察,。