微生物具有容易變異的特性,，因此，在保藏過程中,，必須使微生物的代謝處于zui不活躍或相對靜止的狀態(tài),，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。
　　低溫,、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素,，所以，菌種保藏方法雖多,，但都是根據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)的,。

一、保藏方法大致可分為以下幾種：
　　1．傳代培養(yǎng)保藏法
　　又有斜面培養(yǎng),、穿刺培養(yǎng),、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細(xì)菌用），培養(yǎng)后于4—6℃冰箱內(nèi)保存,。
　　2．液體石蠟覆蓋保藏法
　　是傳代培養(yǎng)的變相方法,，能夠適當(dāng)延長保藏時(shí)間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟,，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡,，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用,。
　　3．載體保藏法
　　是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體,，如土壤、沙子,、硅膠,、濾紙上，而后進(jìn)行干燥的保藏法,，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛,。
　　4．寄主保藏法
　　用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒,、立克次氏體,、螺旋體等，它們必須在生活的動(dòng)物、昆蟲,、雞胚內(nèi)感染并傳代,，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏,。
　　5．冷凍保藏法
　　可分低溫冰箱（-20—-30℃,，-50—-80℃）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法,。
　　6．冷凍干燥保藏法
　　先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍,，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。
　　有些方法如濾紙保藏法,、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護(hù)劑來制備細(xì)胞懸液,，以防止因冷凍或水分不斷升華對細(xì)胞的損害。保護(hù)性溶質(zhì)可通過氫和離子鍵對水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型,。保護(hù)劑有牛乳,、血清、糖類,、甘油,、二甲亞砜等。

二,、器材:　　細(xì)菌,、酵母菌，放線菌和霉菌,；
　　肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基,，滅菌脫脂牛乳，滅菌水,，化學(xué)純的液體石蠟,，甘油，五氧化二磷,，河沙,，瘦黃土或紅土，冰塊,、食鹽,，干冰，95％酒精,，10％鹽酸,，無水氯化鈣；
　　滅菌吸管,，滅菌滴管,，滅菌培養(yǎng)皿,，管形安瓿管,，淚滴形安瓿管（長頸球形底）,，40目與 100目篩子，油紙,，濾紙條（0．5×1．2cm）,，干燥器，真空泵,，真空壓力表,，噴燈，L形五通管,，冰箱,，低溫冰箱（-30℃），液氮冷凍保藏器,。

三,、操作步驟、各保藏法的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)
　　下列各法可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體條件與需要選做,。
　　1．斜面低溫保藏法
　　將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上,，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好,，移至2—8℃的冰箱中保藏,。
　　保藏時(shí)間依微生物的種類而有不同，霉菌,、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存2—4個(gè)月,，移種一次。酵母菌兩個(gè)月,，細(xì)菌每月移種一次,。
　　此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法，優(yōu)點(diǎn)是操作簡單,，使用方便,，不需特殊設(shè)備，能隨時(shí)檢查所保藏的菌株是否死亡,、變異與污染雜菌等,。缺點(diǎn)是容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理,、化學(xué)特性不是嚴(yán)格恒定的,，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀,；污染雜菌的機(jī)會亦較多,。
　　2．液體石蠟保藏法
　　（1）將液體石蠟分裝于三角燒瓶內(nèi)，塞上棉塞,，并用牛皮紙包扎,，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘,，然后放在40℃溫箱中,，使水汽蒸發(fā)掉，備用,。
　?。?）將需要保藏的菌種，在zui適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使得到健壯的菌體或孢子,。
　　（3）用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟,，注入已長好菌的斜面上,，其用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn)（圖Ⅶ-12），使菌種與空氣隔絕,。

　?。?）將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時(shí)間還要長）,。
　　此法實(shí)用而效果好,。霉菌、放線菌,、芽孢細(xì)菌可保藏2年以上不死,，酵母菌可保藏1—2年，一般無芽孢細(xì)菌也可保藏1年左右,，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌,，在37℃溫箱內(nèi)，亦可保藏3個(gè)月之久,。此法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡單,，不需特殊設(shè)備，且不需經(jīng)常移種,。缺點(diǎn)是保存時(shí)必須直立放置,，所占位置較大，同時(shí)也不便攜帶,。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后,，接種環(huán)在火焰上燒灼時(shí)，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺,，應(yīng)特別注意,。
　　3．濾紙保藏法
　?。?）將濾紙剪成0．5×1．2cm的小條，裝入0．6×8cm的安瓿管中,，每管1—2張,，塞以棉塞，1．05kg/cm2>,，121．3℃滅菌30分鐘,。
　?。?）將需要保存的菌種,，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長,。
　?。?）取滅菌脫脂牛乳1—2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻,，制成濃懸液,。
　　（4）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi),，使其吸飽,，再放回至安瓿管中，塞上棉塞,。
　?。?）將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干,。
　?。?）將棉花塞入管內(nèi)，用火焰按圖Ⅶ-13熔封,，保存于低溫下,。

　　（7）需要使用菌種,，復(fù)活培養(yǎng)時(shí),，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位,，使玻璃破裂,，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后,，取出濾紙,，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng),。
　　細(xì)菌,、酵母菌,、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右,，有些絲狀真菌甚至可保藏14—17年之久,。此法較液氮、冷凍干燥法簡便,，不需要特殊設(shè)備,。
　　4．沙土保藏法
　　（1）取河沙加入10％稀鹽酸,，加熱煮沸30分鐘,，以去除其中的有機(jī)質(zhì)。
　?。?）倒去酸水,，用自來水沖洗至中性。
　?。?）烘干,，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒,，備用,。
　　（4）另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土,，加自來水浸泡洗滌數(shù)次,，直至中性。
　?。?）烘干,，碾碎，通過100目篩子過篩,，以去除粗顆粒,。
　　（6）按一份黃土,、三份沙的比例（或根據(jù)需要而用其他比例,，甚至可全部用沙或全部用土）摻合均勻，裝入10×100mm的小試管或安瓿管中,，每管裝1g左右,，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌,，烘干,。
　　（7）抽樣進(jìn)行無菌檢查,，每10支沙土管抽一支,，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中,，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，若仍有雜菌,，則需全部重新滅菌,，再作無菌試驗(yàn)，直至證明無菌,，方可備用,。
　　（8）選擇培養(yǎng)成熟的（一般指孢子層生長豐滿的,，營養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好）優(yōu)良菌種,，以無菌水洗下，制成孢子懸液,。
　?。?）于每支沙土管中加入約0．5ml（一般以剛剛使沙土潤濕為宜）孢子懸液,，以接種針拌勻,。
　　（10）放入真空干燥器內(nèi),，用真空泵抽干水分,，抽干時(shí)間越短越好，務(wù)使在12小時(shí)內(nèi)抽干,。
　?。?1）每10支抽取一支，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒,，接種于斜面培養(yǎng)基上,，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長情況和有無雜菌生長,，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長,，則說明制作的沙土管有問題，尚須進(jìn)一步抽樣檢查,。
　?。?2）若經(jīng)檢查沒有問題，用火焰熔封管口,，放冰箱或室內(nèi)干燥處保存,。每半年檢查一次活力和雜菌情況。
　?。?3）需要使用菌種,，復(fù)活培養(yǎng)時(shí)，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi),，置溫箱中培養(yǎng),。
　　此法多用于能產(chǎn)生孢子的微生物如霉菌,、放線菌，因此在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用zui廣,，效果亦好,，可保存2年左右，但應(yīng)用于營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳,。
　　5．液氮冷凍保藏法
　?。?）準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂,，因此,，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的,，或能容1．2mm液體的,。
　　（2）加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌,、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí),，則將空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2,，121．3℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液,，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1．05kg/cm2>,，121．3℃滅菌15分鐘,。
　　（3）接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液,，裝入已滅菌的安瓿管,；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊,，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi),，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞,。
　?。?）凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍,，則在細(xì)胞內(nèi)會形成冰的結(jié)晶,，因而降低存活率。
　?。?）保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器（圖Ⅶ-14）的小圓筒內(nèi),，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃,，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃,。
　?。?）恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí)，將安瓿管取出,，立即放入38—40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍,，直到全部融化為止。再打開安瓿管,，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng),。
　　此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體,、衣原體,、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌,、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長期保藏,，而且性狀不變異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備,。

　　6．冷凍干燥保藏法
　?。?）準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的,，亦稱淚滴型安瓿管（圖Ⅶ-15）,，大小要求外徑6—7．5mm,，長105mm,，球部直徑9—11mm，壁厚0．6—1．2mm,。也可用沒有球部的管狀安瓿管,。塞好棉塞，1．05kg/cm2>,，121．3℃滅菌30分鐘,，備用。

　?。?）準(zhǔn)備菌種,，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年,，為了在許多年后不出差錯(cuò),，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染,，然后在zui適培養(yǎng)基中用zui適溫度培養(yǎng),，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期,，若用對數(shù)生長期的菌種進(jìn)行保藏,，其存活率反而降低,。一般，細(xì)菌要求24—48小時(shí)的培養(yǎng)物,；酵母需培養(yǎng)3天,；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7—10天,。
　?。?）制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中,，制成濃菌液,，每支安瓿管分裝0．2ml。
　?。?）冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售,，價(jià)值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置,，可達(dá)到同樣的目的,。
　　將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO2>）酒精液或干冰丙酮液,，溫度可達(dá)-70℃,。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4—5分鐘,，即可使懸液結(jié)冰,。
　　（5）真空干燥為在真空干燥時(shí)使樣品保持凍結(jié)狀態(tài),，需準(zhǔn)備冷凍槽,，槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽，混合均勻,，可冷至-15℃,。裝置儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內(nèi),。
　　抽氣一般若在30分鐘內(nèi)能達(dá)到93．3Pa（0．7mmHg）真空度時(shí),，則干燥物不致熔化，以后再繼續(xù)抽氣,，幾小時(shí)內(nèi),，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg）,，保持壓力6—8小時(shí)即可,。
　　（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管,，接在封口用的玻璃管上,，可用L形五通管（圖Ⅶ-17）繼續(xù)抽氣，約10分鐘即可達(dá)到26．7Pa（0．2mmHg）,。于真空狀態(tài)下,，以煤氣噴燈的細(xì)火焰在安瓿管頸*進(jìn)行封口。封口以后,，保存于冰箱或室溫暗處,。
　　此法為菌種保藏方法中zui有效的方法之一，對一般生活力強(qiáng)的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用,，即使對一些很難保存的致病菌,，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存,，一般可保存數(shù)年至十余年,，但設(shè)備和操作都比較復(fù)雜。