細(xì)胞分離技術(shù)

一,、從原代組織中分離細(xì)胞 將組織塊分離（散）成細(xì)胞懸液的方法有多種，zui常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法,、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法,。

從原代組織中獲得單細(xì)胞懸液的一般方法是酶解聚。細(xì)胞暴露在酶中的時(shí)間要盡可能的短,，以保持zui大的活性,。下列步驟可以解聚整個(gè)組織，獲得較高產(chǎn)量的有活性細(xì)胞,。

1.胰蛋白酶 （Trypsin）
●在去除不需要的組織后,，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片,。讓組織碎片沉淀,，去除上清液。重復(fù)清洗2到3次,。
●將盛有組織碎片的容器置于冰上,，去除殘留的上清液。加入0.25％溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。
●在4℃孵育6到18小時(shí),，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去,。
●移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘,。
●在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基,，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基,，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。
●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200mm）過濾,，分散所有剩余組織,。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng),。

2.膠原酶 （Collagenase）
●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片,，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。
●加入膠原酶（50～200單位/ml,，溶解在HBSS中）,。
●在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率,。
●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液,，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片,。如果需要進(jìn)一步的解聚,，在碎片中加入新鮮的膠原酶。
●通過離心在HBSS中清洗懸液幾次,。
●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞,，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng),。

3.Dispase
●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片,，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。
●加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液）
●在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí),。
●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液,，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片,。如果需要進(jìn)一步的解聚,，在碎片中加入新鮮的Dispase。
●通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次,。
●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞,，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

二,、從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞:以下是從基層迅速分離細(xì)胞,，且保持細(xì)胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對(duì)于所有細(xì)胞系的廣泛應(yīng)用,，每一種系統(tǒng)*條件和施用濃度應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)加以確定,。
●再次培養(yǎng)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的活性。
●細(xì)胞的活率應(yīng)該超過90％
●對(duì)于無血清培養(yǎng)基,，降低胰蛋白酶使用量,。

1. 移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基。

2. 使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA（ethylene diamine tetraacetic acid,，乙二胺四乙酸.）清洗細(xì)胞（看表確定正確的清洗溶液）,。在培養(yǎng)瓶對(duì)著細(xì)胞的一面加入清洗溶液，通過轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層,，然后去除清洗液,。

3. 以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液（見表）到培養(yǎng)瓶對(duì)著細(xì)胞的一面,。確保分離液覆蓋細(xì)胞層,。在37℃孵育培養(yǎng)瓶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,。通常,，在5到15分鐘內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)脫落,。細(xì)胞分離需要的時(shí)間因細(xì)胞系不同而有所變化,。仔細(xì)監(jiān)測(cè)細(xì)胞分離過程，避免細(xì)胞受損傷,。對(duì)難于從培養(yǎng)瓶基層分離的細(xì)胞系,，可以輕輕敲打，以加速分離過程,。

4. 當(dāng)細(xì)胞*分離時(shí),，垂直放置培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部,。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基,，通過移液管在單層細(xì)胞表面反復(fù)吹打來分散細(xì)胞。計(jì)數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞,。

5. 對(duì)于無血清培養(yǎng)基,，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性,。

第三節(jié) 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

為了防止因污染或技術(shù)原因使長(zhǎng)期培養(yǎng)功虧一簣,，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會(huì)出現(xiàn)變異,，有時(shí)因寄贈(zèng)、交換和購(gòu)買,，培養(yǎng)細(xì)胞從一個(gè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室,，*的策略是進(jìn)行低溫保存。這對(duì)于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要?，F(xiàn)簡(jiǎn)要介紹深低溫保存法（－70℃~－196℃）的特點(diǎn),。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止,，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài),，故可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵,，在于通過0~20℃階段的處理過程,。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀,，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

一,、細(xì)胞的凍存:為避免污染造成的損失,，zui小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞,。凍存細(xì)胞前,，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。

有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細(xì)胞,。對(duì)于包含有血清的培養(yǎng)基,，成分可能如下：
◆包含10％甘油的*培養(yǎng)基，
◆包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養(yǎng)基,，
◆50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％甘油的新鮮培養(yǎng)基,，或
◆50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。
對(duì)于無血清培養(yǎng)基,，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：
◆50％ 細(xì)胞條件無血清培養(yǎng)基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基,，或
◆包含有7.5％二甲基亞砜和10％細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。

1.懸浮細(xì)胞
●計(jì)數(shù)將要凍存的活細(xì)胞,。細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細(xì)胞，使用移液管移去上清到zui小體積,，不要攪亂細(xì)胞,。
●以1×107到5×107細(xì)胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞,，或者以0.5×107到1×107在無血清培養(yǎng)基中,，再次懸浮細(xì)胞,。
●分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中,，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟,。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存,。

2.貼壁細(xì)胞
●使用分離試劑從基層分離細(xì)胞，分離時(shí)盡可能溫和,，使對(duì)細(xì)胞的損傷減少到zui小,。
●在*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞,，確定有活力細(xì)胞數(shù),。
●以大約200g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到zui小體積,，不要攪亂細(xì)胞,。
●以5×106到1×106細(xì)胞/ml密度，在凍存液中懸浮細(xì)胞,。
●分裝進(jìn)凍存管,，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟,。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍,，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存,。

二,、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇:凍存細(xì)胞較脆弱，要輕柔操作,。凍存細(xì)胞要快速融化,，并直接加入*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。若細(xì)胞對(duì)凍存劑（DMSO或甘油）敏感,，離心去除凍存培養(yǎng)基,，然后加入*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。

1.直接鋪板方法
●取出貯存細(xì)胞,，37℃水浴中快速融化,。
●直接用*生長(zhǎng)培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。1ml凍存細(xì)胞使用10~20ml*生長(zhǎng)培養(yǎng)基,。進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),，細(xì)胞接種應(yīng)該至少在3×105活細(xì)胞/ml。
●培養(yǎng)細(xì)胞12到24小時(shí),，更換新鮮的*生長(zhǎng)培養(yǎng)基,，去除凍存劑,。
2.離心方法
●取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化,。
●把1到2ml凍存細(xì)胞加入到大約25ml*生長(zhǎng)培養(yǎng)基,，輕輕混勻。
●以大約80x g離心2到3分鐘,。
●棄去上清,。
●在*生長(zhǎng)培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞，并且進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),。
●細(xì)胞鋪板,，細(xì)胞接種應(yīng)該至少為3×105活細(xì)胞/ml。

三,、細(xì)胞的分化,、衰老與死亡

1．細(xì)胞的分化:一個(gè)成年人全身細(xì)胞總數(shù)約1012個(gè)，可以區(qū)分為200多種不同類型的細(xì)胞：形態(tài)結(jié)構(gòu),，代謝,，行為，功能等各不相同,。追根溯源,，這么多種細(xì)胞均來自一個(gè)受精卵細(xì)胞。所以,，通常把發(fā)育過程中，細(xì)胞后代在形態(tài),、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程稱為細(xì)胞分化,。細(xì)胞分化發(fā)生在胚胎階段，也發(fā)生在胎兒出生以后,，乃至成人階段,。例如，人體血細(xì)胞的產(chǎn)生和分化,，這個(gè)過程在人的一生中一直持續(xù)著,。

由旺盛生長(zhǎng)不斷分裂的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入分化,，通常從細(xì)胞周期中G1期開始時(shí)一個(gè)確定的點(diǎn)G0點(diǎn)“逃逸”出細(xì)胞周期,。旺盛生長(zhǎng)分裂的細(xì)胞和各種分化了的細(xì)胞，它們的基因表達(dá)和代謝活動(dòng)各不相同,。

2．細(xì)胞的衰老:體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明：

成纖維細(xì)胞：來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡（與具體年齡有關(guān)）;來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡,。

細(xì)胞衰老過程中會(huì)發(fā)生一系列的變化，包括：蛋白質(zhì)合成速度降低,，已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化,，特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn),；同時(shí)，細(xì)胞核,，線粒體,，膜系統(tǒng)、骨架系統(tǒng)等都有結(jié)構(gòu),、功能的改變,。

細(xì)胞衰老原因，尚無定論,，出現(xiàn)過好幾種理論與假說,，其中得到較廣泛認(rèn)可的是“自由基損傷假說”。

3．細(xì)胞凋亡:細(xì)胞的死亡是個(gè)體存活的正?，F(xiàn)象,，常見的細(xì)胞死亡形式有3種：壞死、凋亡和細(xì)胞毒性,。多細(xì)胞生物的生命活動(dòng)中,，因?yàn)榄h(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵，導(dǎo)致一部分細(xì)胞死去,，稱為細(xì)胞的病理死亡,，或細(xì)胞壞死。壞死是細(xì)胞暴露于嚴(yán)重的物理或化學(xué)刺激時(shí)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡,；細(xì)胞毒性是由細(xì)胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細(xì)胞殺傷事件,，不依賴于其它兩種細(xì)胞死亡機(jī)理，如殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用,。

還有一種情況,，一部分細(xì)胞的死亡是生物個(gè)體正常生命活動(dòng)（代謝、生長(zhǎng),、發(fā)育,、分化）的一個(gè)必要部分；似乎帶有“犧牲局部,，保全整體”的意味,。這種情況下的細(xì)胞死亡，明顯地受遺傳控制,，稱為細(xì)胞凋亡,。 凋亡（Apoptosis）則是程序性的、正常的細(xì)胞死亡,，是機(jī)體清除無用的或者不想要的細(xì)胞的手段,。它與細(xì)胞壞死是兩個(gè)截然不同的過程，無論從形態(tài)學(xué),、生物學(xué)還是生化的特征來說,，都有明顯的區(qū)別,。細(xì)胞凋亡現(xiàn)象普遍存在于生物界。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖,、分化和衰老起著互補(bǔ)與平衡的作用,，在多細(xì)胞動(dòng)物的發(fā)育、形態(tài)建成與維持中扮演至關(guān)重要的角色,。作為細(xì)胞的一種基本生命現(xiàn)象,，凋亡失控的結(jié)果將是可怕的：凋亡不足時(shí)，易發(fā)生癌變,、病毒性疾病和自身免疫疾?。欢蛲鲞^量則可能產(chǎn)生獲得性免疫缺陷綜合征（HIV）,、重癥肝炎與退行性神經(jīng)疾病,，如老年性癡呆癥（Alzheimer's disease）、帕金森氏癥（Parkinson's disease）,。因此研究細(xì)胞凋亡及其機(jī)理具有重要的理論和實(shí)踐意義,。

細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別

壞死

形態(tài)學(xué)特征-膜完整性喪失,胞漿和線粒體膨脹 ,全細(xì)胞裂解

生化特征-離子內(nèi)環(huán)境失調(diào),非能量依賴性的（被動(dòng)過程，在4°C也可以發(fā)生）,隨機(jī)消化DNA（電泳顯示為DNA彌散狀態(tài)）,Postlytic DNA斷裂

生理學(xué)特征-影響群組細(xì)胞 由非生理學(xué)因素引起（如補(bǔ)體攻擊,、代謝中毒,、缺氧等）,被巨噬細(xì)胞吞噬, 周圍有明顯的炎癥反應(yīng)

凋亡

形態(tài)學(xué)特征-胞膜出芽，但保持完整,染色體聚集在核膜周邊,胞漿收縮,、細(xì)胞核凝集,zui后細(xì)胞分裂為凋亡小體,Bcl-2家族蛋白導(dǎo)致線粒體膜通透性增加

生化特征--ATP依賴性的（主動(dòng)過程,，在4°C不能發(fā)生）,以核小體為單位剪切DNA（電泳顯示為DNA ladder）,Prelytic DNA 斷裂,線粒體釋放多種因子至胞漿中（細(xì)胞色素c、AIF）,Caspases級(jí)聯(lián)活化,膜對(duì)稱性改變（PS外翻）

生理學(xué)特征--只影響單個(gè)細(xì)胞 ,由生理學(xué)刺激誘導(dǎo)（如生長(zhǎng)因子缺乏,、激素環(huán)境改變等）,被臨近細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬 無炎癥反應(yīng)