腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置,，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞,。當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是zui多的,。另外腫瘤對(duì)人類(lèi)是威脅zui大的疾病,。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理,、抗癌藥檢測(cè),、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用,。

一,、組織培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性

腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外,，在形態(tài),、生長(zhǎng)增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同,。生長(zhǎng)在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞,，其差異較小，但也并非*相同,。培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞具以下突出特點(diǎn)：

（－）形態(tài)和性狀

培養(yǎng)中癌細(xì)胞無(wú)光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài),，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰,，核膜、核仁輪廓明顯,，核糖體顆粒豐富,。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則,，可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運(yùn)動(dòng)和錨著不依賴(lài)性有關(guān),。

（二）生長(zhǎng)增殖

腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此,。正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖,，是因血清中含有很細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的因子，而癌細(xì)胞在低血清中（2％～5％）仍能生長(zhǎng),。已證明腫瘤細(xì)胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力,。正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的現(xiàn)象,，已成為檢測(cè)細(xì)胞惡變的一個(gè)指標(biāo),。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜?xì)胞強(qiáng),。另外癌細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴(kuò)展時(shí)，接觸抑制消除,，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展,，形成堆積物。

（三）永生性

永生性也稱(chēng)不死性,。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無(wú)限傳代而不凋亡（Apoptosis）,。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞是否如此尚無(wú)直接證明,。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡,，從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細(xì)胞的永生性是否能反證它在體內(nèi)時(shí)同樣如此,？也尚難肯定,。從近年建立細(xì)胞系或株的過(guò)程說(shuō)明，如果永生性是體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所固有的,，腫瘤細(xì)胞應(yīng)易于培養(yǎng),。事實(shí)上，多數(shù)腫瘤細(xì)胞初代培養(yǎng)時(shí)并不那么容易,。生長(zhǎng)增殖并不旺盛,；經(jīng)過(guò)純化成單一化瘤細(xì)胞后，也大多增殖若干代后,，便出現(xiàn)類(lèi)似二倍體細(xì)胞培養(yǎng)中的停滯期,。過(guò)此階段后才獲得永生性,，順利傳代生長(zhǎng)下去。從而說(shuō)明體外腫瘤細(xì)胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的,。從一些具有永生性而無(wú)惡性性的細(xì)胞系,，如NIH3T3、Rat－1,、10T1/2等細(xì)胞證明,，永生性和惡性（包括浸潤(rùn)性）是兩種性狀，受不同基因調(diào)控,，但卻有相關(guān)性,。可能永生性是細(xì)胞惡變的階段。至少在體外是如此,。

（四）浸潤(rùn)性

浸潤(rùn)性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為,，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時(shí),，能浸潤(rùn)入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長(zhǎng)的能力,。

（五）異質(zhì)性

所有腫瘤都是由有增殖能力,、遺傳性、起源,、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成,。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲得血液供應(yīng)多,，增殖旺盛,，中心區(qū)有的細(xì)胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài),，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱(chēng)干細(xì)胞（Stem Cells）,、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長(zhǎng)的成分。腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)易于生長(zhǎng)增殖,；把干細(xì)胞分離出來(lái)的培養(yǎng)方法稱(chēng)干細(xì)胞培養(yǎng),。

（六）細(xì)胞遺傳

大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型,、呈異倍體或多倍體等,。腫瘤細(xì)胞群常由多個(gè)細(xì)胞群組成，有干細(xì)胞系和數(shù)個(gè)亞系,，并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變,。

（七）其它

腫瘤細(xì)胞在體外不易生長(zhǎng)的原因可能由于：

①依賴(lài)性：腫瘤細(xì)胞雖有較強(qiáng)克隆生長(zhǎng)力，但仍有一定的群體性或與其它細(xì)胞相依存關(guān)系,。一是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互依存,，二是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的依賴(lài),。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細(xì)胞后也會(huì)同時(shí)消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的活性,；

②腫瘤細(xì)胞的自泌也會(huì)因分散培養(yǎng)而被稀釋?zhuān)_(dá)不到腫瘤生長(zhǎng)的需求,，降低腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖力；

③并非所有腫瘤細(xì)胞都有強(qiáng)的生長(zhǎng)活力和長(zhǎng)的Life Span,，只有干細(xì)胞才有強(qiáng)的增殖生長(zhǎng)能力,，但這些細(xì)胞數(shù)量很少；

④離體培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件,。

二,、培養(yǎng)方法

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除,、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方面,。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無(wú)原則差別,，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可,。

1．取材：

人腫瘤細(xì)胞來(lái)自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要,，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū),，取材時(shí)盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位,。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料,。取材后宜盡快進(jìn)行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng),，可貯存于4℃中,，但不宜栽過(guò)24小時(shí)。

2．培養(yǎng)基：

腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格,，一般常用的 RPMIl640,、 DMEM、Mc-Coy等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng),。腫瘤細(xì)胞對(duì)血清的需求比正常細(xì)胞低,，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長(zhǎng),。腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大,，是因腫瘤細(xì)胞有自泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長(zhǎng)物質(zhì)之故。但這并不說(shuō)明腫瘤細(xì)胞*不需要這些成分,。按不同細(xì)胞需要不同的生長(zhǎng)因子,；腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間對(duì)生長(zhǎng)因子的需求都存在著差異,。但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中仍需要生長(zhǎng)因子,。有的還需特異性生長(zhǎng)因子〔如乳腺癌細(xì)胞等）,。總之培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長(zhǎng)因子培養(yǎng)更易成功,。

3．成纖維細(xì)胞的排除：

成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng),，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)得快,，zui終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。排除成纖維細(xì)胞有多種方法（表2－1）,。

表2－1 抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因素

方法	因素	組織細(xì)胞
選擇性附著 選擇性附著底物 匯合飼細(xì)胞層 選擇性培養(yǎng)基	胰蛋白酶 膠原酶 聚丙烯酰胺 聚四氟乙烯（Teflon） 膠原（豬皮） 小鼠3T3 人胎小腸 D-纈氨酸（Valine） MCDB-710 MCDB-153 Phenobarbitone	胚胎小腸,、心肌、表皮 乳癌 各種腫瘤 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 表皮細(xì)胞 表皮 正常和惡性乳腺上皮 結(jié)腸癌 腎組織 乳腺 表皮 肝細(xì)胞

注：上表結(jié)果為個(gè)別實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn),，僅供參考


三,、成纖維細(xì)胞排除法

1．機(jī)械刮除法：

是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成,，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）,。刮除程序?yàn)椋?

（1）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的部位,；

（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液,，把無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下,，刮除無(wú)標(biāo)記空間；

（3）用Hanks液沖洗一兩次,，洗除被刮掉的細(xì)胞,；

（4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留,，可重復(fù)刮除至*除掉為止

2．反復(fù)貼壁法：

根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn),，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，把含有兩類(lèi)細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁,，使兩類(lèi)細(xì)胞相互分離,，操作方法與傳代相同。

（1）待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后,，倒出舊培養(yǎng)液,，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次,，加入不含血清的培養(yǎng)液,，吹打制成細(xì)胞懸液；

（2）取編號(hào)為此A,、B,、C三個(gè)培養(yǎng)瓶,；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后,，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶,，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后,；向A瓶中補(bǔ)充少許*培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng),；

（3）培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5～20分鐘后，接處理A的方法,，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中,；再向B瓶中補(bǔ)加*培養(yǎng)基。
當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后,，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng),。如操作成功，次日觀察可見(jiàn)A瓶主要為成纖維細(xì)胞,，B瓶?jī)深?lèi)細(xì)胞相雜,，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次,，直至癌細(xì)胞純化為止,。

3．消化排除法：

此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng)，具體程序是：

（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次,，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化,，并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來(lái)后,，便立即停止消化,；

（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清,，吸入另瓶中,，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶?jī)?nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),。用此法處理后,，成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落。經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理,，可能把成纖維細(xì)胞除凈,。

4．膠原酶消化法：

本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇,。

（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理,，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化,；

（2）用Hanks洗滌處理一次后,，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng),，可獲純凈腫瘤細(xì)胞,。如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù),。

5．其它方法：

有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細(xì)胞懸液后,，在23℃中800g離心 10分種,。在比重1.025～1.050層為成纖維細(xì)胞，在比重1.050～1.085層為上皮細(xì)胞,，再經(jīng)過(guò)分離進(jìn)行培養(yǎng),。zui近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。

選用上述任何一種方法,，都需進(jìn)行試驗(yàn),，取得必要經(jīng)驗(yàn)，找出適合的條件,，才能獲得好的效果,。

四、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長(zhǎng)率措施

根據(jù)人們的經(jīng)驗(yàn),，腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng),，建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。當(dāng)腫瘤組織或細(xì)胞初代接種培養(yǎng)后,，常出現(xiàn)以下幾種情況：

*無(wú)細(xì)胞游出或移動(dòng),；

有細(xì)胞移動(dòng)和游出，但無(wú)細(xì)胞增殖,，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代,；

有細(xì)胞增殖,，傳若干代后停止生長(zhǎng)或衰退死亡,；

傳數(shù)代后細(xì)胞增殖緩慢，經(jīng)過(guò)一段停滯期后,，才又呈旺盛生長(zhǎng)狀態(tài),，形成穩(wěn)定生長(zhǎng)的腫瘤傳代細(xì)胞系。

以上現(xiàn)象說(shuō)明腫瘤細(xì)胞對(duì)體外生存條件有較高的要求,，并需經(jīng)過(guò)對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)才能生長(zhǎng),，因此欲獲得好的培養(yǎng)效果，不能局限于一般培養(yǎng)法，必須采用一些特殊的措施,。

1．適宜底物：把經(jīng)過(guò)純化的細(xì)胞接種在不同的底物上,，如鼠尾膠原底層、飼細(xì)胞層等,。

2．生長(zhǎng)因子：應(yīng)用促細(xì)胞生長(zhǎng)因子,，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)不同選用不同的促生長(zhǎng)物,，常用有胰島素,、、雌激素以及其它生長(zhǎng)因子,。

為提高腫瘤細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細(xì)胞（干細(xì)胞）的數(shù)量,，可采用動(dòng)物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后，再?gòu)膭?dòng)物體內(nèi)取出進(jìn)行培養(yǎng),，能提高體外培養(yǎng)的成功率,。受體動(dòng)物以裸鼠。

3.動(dòng)物體媒介培養(yǎng)方法：

（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織,，用Hanks液洗凈血污,，切成1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊,，用酒精棉球擦拭動(dòng)物腹部后,，直接刺入皮下，注入瘤塊,；

（2）飼養(yǎng)觀察,，待腫瘤生長(zhǎng)達(dá)較大體積后，剝?nèi)〕隽鼋M織,；

（3）進(jìn)行體外培養(yǎng),。

（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續(xù)在裸鼠體內(nèi)傳代,。通過(guò)裸鼠媒介接種,，有活力的腫瘤細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞培養(yǎng)易于成功,。

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法與培養(yǎng)正常細(xì)胞*相同,，但成功率比正常細(xì)胞高。

五,、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)

一旦培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)成形態(tài)上單一的細(xì)胞群體或細(xì)胞系（或株）后,，不論用于實(shí)驗(yàn)研究還是建立細(xì)胞系，都需要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)測(cè)定,，主要的目的在于求得證明：

所培養(yǎng)的細(xì)胞系的確來(lái)源于原體內(nèi)具有惡性的細(xì)胞,，而非正常細(xì)胞或其它細(xì)胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學(xué)性狀,。測(cè)定項(xiàng)目數(shù)量無(wú)明確規(guī)定,，根據(jù)需要而定，以下為常做的項(xiàng)目和要點(diǎn),。

【形態(tài)觀察】主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài),，如大體形態(tài)、核漿比例,、染色質(zhì)和核仁大小,、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。

【細(xì)胞生長(zhǎng)增殖】檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn),、細(xì)胞分裂指數(shù),、倍增時(shí)間、細(xì)胞周期時(shí)間,。

【細(xì)胞核型分析】檢測(cè)核型特點(diǎn),，染色體數(shù)量、標(biāo)記染色體的有無(wú),、帶型等,。

【凝集試驗(yàn)】檢測(cè)凝集力。

【軟瓊脂培養(yǎng)】檢測(cè)集落形成能力,。

【異體動(dòng)物接種】向異體動(dòng)物體內(nèi)（皮下）接種細(xì)胞懸液,，觀察成瘤能力。

【其它】除上述項(xiàng)目外,，根據(jù)需要還可做同位素標(biāo)記,、組織化學(xué)成分分析，熒光顯微鏡觀察等,。

在上述腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)中,，zui主要的為：異體動(dòng)物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養(yǎng),、核型分析,、細(xì)胞骨架和電鏡觀察等幾項(xiàng)。當(dāng)然從分子細(xì)胞學(xué)角度考慮尚應(yīng)做癌基因和抗癌基因等的檢測(cè),，這些項(xiàng)目將在本書(shū)第二篇中介紹,。

六、對(duì)腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株的評(píng)價(jià)

已建成的各種腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株,，無(wú)疑都是可用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,。近年我國(guó)已建成的腫瘤細(xì)胞系已非常多,，并獲得越來(lái)越廣泛的應(yīng)用,。但根據(jù)研究者的經(jīng)驗(yàn)，在使用這些細(xì)胞系時(shí)，應(yīng)持特別審慎態(tài)度,，主要是應(yīng)考慮到這些細(xì)胞在長(zhǎng)期傳代中有否發(fā)生遺傳性改變的可能,。*，長(zhǎng)期傳代細(xì)胞系染色體核型常是不穩(wěn)定的,。另外也可能發(fā)生如基因突變,、基因易位或缺失等變化。其結(jié)果可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)性狀上的變動(dòng),。以近年建成的各種腫瘤細(xì)胞系為例,，都已傳代少則幾十，多則百代以上后,，才確認(rèn)建成了細(xì)胞系,。這種情況下很難保證細(xì)胞從初代到建成時(shí)的性狀仍是一致的。

已如前述,，癌細(xì)胞在培養(yǎng)中并非能很順利地傳下去,，凡已長(zhǎng)期傳代的細(xì)胞系，都已獲得不死性,。當(dāng)前尚未*確證所有癌細(xì)胞都具有不死性,；因此尚難肯定在長(zhǎng)期培養(yǎng)中的癌細(xì)胞的生物學(xué)性狀與體內(nèi)時(shí)仍*相同（包括不死性）。據(jù)上述對(duì)用癌細(xì)胞系所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)盡量做分析性的結(jié)論,，避免做概括性的與體內(nèi)等同的結(jié)論,，外推與體內(nèi)等同更是不妥的。廣泛來(lái)說(shuō),，應(yīng)用各種較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)時(shí),，都應(yīng)如此。