細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法）

三.吹打分散細(xì)胞：
1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液,。
2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。
3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機(jī)中,，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘,。
4.棄上清液,，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液,，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,。
四.分裝稀釋細(xì)胞：
1.分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋,。
2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量,，必要是計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細(xì)胞的生長,，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml,，zui后要做好標(biāo)記。
五.繼續(xù)培養(yǎng)：
用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶,，適當(dāng)旋松瓶蓋,，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時后開始貼附在瓶壁上,。當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時為一個＋,，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋,。
傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項：
1.嚴(yán)格的無菌操作,。
2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間,、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響,，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮,，連接變松散,，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：
EDTA 0.20g,，NaCl 8.00g,， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g,，葡萄糖 2.00g,，0.5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml,。10磅20min高壓滅菌,，使用時調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和,，使用后培養(yǎng)瓶要*清洗，否則再培養(yǎng)時細(xì)胞容易脫壁,。