正常人胚肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 肺組織：取自妊娠14—18周的胎兒,；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素,、200mg/L鏈霉素,，pH7.2；

3. 消化液：0.25%胰蛋白酶（pH7.6—7.8）,，0.02%EDTA溶液,；

4. 培養(yǎng)液：DMEM或RPMI1640，加10%—20%胎牛血清,、青霉素100IU/ml,、鏈霉素100μg/ml；

5. 保存液：10%二甲亞砜或10%甘油,；

6. 眼科剪,、眼科鑷等無(wú)菌消毒手術(shù)器械；

7. 離心管（15ml,、50ml）

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 取水囊引產(chǎn)的妊娠3—6個(gè)月的胎兒,。用75%乙醇消毒胸壁。剖胸取出兩肺,。剪去肺內(nèi)較大的支氣管后,，將肺邊緣組織置于平皿中，用PBS液清洗3次,，除去血液,。選擇蒼白色的肺組織，剪成1mm3左右的碎塊,。再用PBS液洗2—3次,，直至液體澄清為止；

2. 將肺組織塊移入三角瓶中,，加入5—6倍量的0.25%胰蛋白酶,，密封瓶口。置4℃冰箱內(nèi)消化20h,；

3. 吸棄上層液體,。往三角瓶中加入少量培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打分散細(xì)胞,。稍靜置,，待殘存的組織塊下沉后,，吸出細(xì)胞懸液；

4. 計(jì)數(shù)細(xì)胞,，并用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度,；

5. 將細(xì)胞以3×106個(gè)/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中,，于37℃,、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。24h后換液，除去未貼壁的細(xì)胞及細(xì)胞碎片,。以后每隔2—3d換液一次,；

6. 待細(xì)胞匯合成片后，用0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA（1：1,，V/V）混合消化液消化細(xì)胞,，進(jìn)行繼代培養(yǎng),；

7. 如果要凍存細(xì)胞，以便長(zhǎng)期使用,，可以將成片細(xì)胞經(jīng)消化分散后，懸浮于保存液中,，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1.5×106—2.0×106個(gè)/ml。每管1—2ml分裝入凍存管,，置于液氮罐中保存,；