凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分技術(shù),，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑,，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果。目前已經(jīng)被生物化學(xué),、分子生物學(xué),、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用,，不但應(yīng)用于科學(xué)實驗研究,，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。    
         
      一,、基本理論    
      （一） 分子篩效益    
      一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經(jīng)凝膠色譜柱時,，各分子在柱內(nèi)同時進(jìn)行著兩種不同的運動：垂直向下的移動和無定向的擴(kuò)散運動。大分子物質(zhì)由于直徑較大,，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔,，而只能分布顆粒之間,，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外,，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中,，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動的過程中,，從一個凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒,，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì),，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱,，中等分子的后流出，分子zui小的zui后流出,，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng),。具有多孔的凝膠就是分子篩。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍,，有zui大極限和zui小極限,。分子直徑比凝膠zui大孔隙直徑大的，就會全部被排阻在凝膠顆粒之外,，這種情況叫全排阻,。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果,。直徑比凝膠zui小孔直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙,。如果兩種分子都能全部進(jìn)入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別,，也不會有好的分離效果,。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍,。綜上所述,，在凝膠色譜中會有三種情況，一是分子很小,，能進(jìn)入分子篩全部的內(nèi)孔隙,；二是分子很大，*不能進(jìn)入凝膠的任何內(nèi)孔隙,；三是分子大小適中,，能進(jìn)入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分。大,、中,、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子,，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的,。對于分子大小不同,，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi),，而分子的可進(jìn)入較多的凝膠顆粒內(nèi),，這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動距離較短，分子較小的移動距離較長,。于是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床,，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。另外,，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),，大的分子在通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時阻力較大，小分子通過時阻力較小,。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時,，按照分子量大小“排隊，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng),。    
         
      二）色譜柱的重要參數(shù)    
      ⑴柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后,，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床,，因引柱體積又稱“床”體積,，常用Vt 表示。    
      ⑵外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙,，這部分體積稱外水體積,，亦稱間隙體積，常用Vo表示,。    
      ⑶內(nèi)水體積：因為凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),，顆粒內(nèi)部仍有空間,，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部,，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積,，常用Vi表示,。 不包括固體支持物的體積（Vg）。    
      ⑷峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液有體積,，常用Ve 表示,。當(dāng)使用樣品的體積很少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計）,，在洗脫圖中,，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。 當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時,，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置,。當(dāng)樣品很大時,，洗脫體積計算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點（或半高處）。    
         
      二,、凝膠的種類及性質(zhì)    
      （一） 交聯(lián)葡聚糖凝膠    
      ⑴Sephadex G交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephndex,，不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍,。例如,，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克,。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10,，G-15，G-25,，G-50,，G-75，G-100,，G-150,，和G-200。因此,，“G”反映,，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍,。    
      ⑵Sephadex LH-20,，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及親脂溶劑,，用于分離不溶于水的物質(zhì),。    
         
      （二） 瓊脂糖凝膠：    
      商品名很多，常見的有,，Sepharose（瑞典,，pharmacia ），Bio-Gel-A（美國Bio-Rad）等,。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下,，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的,，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）,。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化,，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅菌活處理。    
         
      （三）聚丙烯酰胺凝膠：是一種人工合成凝膠,，是以丙烯酰胺為單位,， 由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀,，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠,。交聯(lián)劑越多，孔隙越小,。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠-P （Bio-Gel P），由美國Bio-Rod廠生產(chǎn),，型號很多,，從P-2至P-300共10種，P 后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度,。    
         
      （四）聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel ,， 具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)， 可用于分離分子量1600到40,，000,，000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物,，分子量測定和脂溶性天然物的分級,，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，洗脫劑可用甲基亞砜,。    
         
      三,、實驗技術(shù)    
      （一）層析柱 層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管,。層析柱的直徑大小不影響分離度,，樣品用量大，可加大柱的直徑,，一般制備用凝膠柱,，直徑大于2厘米，但在加樣時應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上,。此外,， 直徑加大,，洗脫液體體積增大,，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高,，為分離不同組分,，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān),，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞,，一般不超過1米,。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米,，柱高與直徑的比較5:1─10:1,，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。 分級分離時柱高與直徑之線為20:1─100:1,，常用凝膠柱有50×25厘米,，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小,，如果支掌濾板下的死體積大,，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影響洗脫峰形,，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力,。在分離時,，死體積不能超過總床體積的1/1000。    
         
      （二）凝膠的選擇 根據(jù)所需凝膠體積,，估計所需干膠的量,。 一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍,，例如Sephadex G-20的吸水量為20,，1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝膠體積約40ml,。凝膠的粒度也可影響層析分離效果,。粒度細(xì)胞分離效果好,，但阻力大,，流速慢。一般實驗室分離蛋白質(zhì)采用100-200號篩目的的Sephadex G-200效果好,， 脫鹽用Sephadex G-25、G-50,，用粗粒,，短柱，流速快,。    
         
      （三）凝膠的制備 商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹,。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸,，這樣可大大中速膨脹,，通常在1-2小時內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時,， 自然膨脹需24小時至數(shù)天,，而用加熱法在幾小時內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時間,，而且還可消毒,，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。    
         
      （四）樣品溶液的處理 樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去,，如含脂類可高速離心或通過Sephadex G-15短柱除去,。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4%,，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定,。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4%（一般約0.5-2ml）,，進(jìn)行分族分離時樣品液可為凝膠床的10%，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時,，樣品可達(dá)凝膠床的20-30%,。 分級分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄,，洗脫出的峰形較好,。    
         
      （五）防止微生物的污染 交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長,，在凝膠層析中十分重要,，常用的抑菌劑有:     
      ⑴疊氨鈉（NaN3）在凝膠層析中只要用0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶一水,，在20℃時約為40%,；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力,；不會改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性,。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。    
         
      ⑵可樂酮[Cl3C-C（OH）（CH3）2]在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02%,。在微酸性溶液中它的殺菌效果*,，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60℃時易引起分解而失效。    
         
      ⑶乙基汞代巰基水楊酸鈉 在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0. 01%,。在微酸性溶液中zui為有效,。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果,。    
         
      ⑷苯基汞代鹽 在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01%,。在微堿性溶液中抑效果*，長時間放置時可與鹵素,、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀,；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用,。