大鼠催產素（OT）酶聯免疫試劑盒使用說明

本試劑盒適用于以下樣本的測試（黑底字體為適用樣本）：

血清、血漿- 組織勻漿 –腹水 –細胞培養(yǎng)上清

本試劑盒僅供研究,，不用于臨床診斷

目錄

1.     實驗原理

2.     試劑盒組成

3.     試劑盒保存

4. 需要而未提供的試劑和器材

5.     試劑準備

6.     樣本前處理

7.     洗板方法

8.     詳細操作程序

9.     操作總結

10.  性能參數

1.     實驗原理：本試劑盒采用競爭法法檢測樣本中催產素（OT） 的含量,。向預先包被了抗體的酶標孔中加入樣本，再加入辣根過氧化物酶標記的識別抗原,，在37℃下孵育1小時,，兩者與固相抗原競爭結合形成免疫復合物，經PBST洗滌后,，結合的HRP催化TMB（四甲基聯苯胺）成藍色,，隨后在酸的作用下轉化成黃色，在450nm波長下有吸收峰,，吸光值與樣本中抗原的濃度成負相關,。

2.試劑盒組成：

備注：

a．              試劑盒中“樣品稀釋液”為0.05M的PBS，“終止液”為2M的H2SO4,，洗滌液為含0.15%吐溫-20的PBST,，如不夠可自行配制。

b.不同公司的緩沖體系存在較大差異,，請勿將本試劑盒的試劑與其他公司的試劑混用以免影響實驗結果,。

c.濃縮洗滌液在低溫下會有少量鹽類析出，稍微加溫后即會消失,，不影響使用,。

3.試劑盒保存

本試劑盒可以在2-8℃下保存6個月,，在-20℃下可以保存更長的時間。酶標板為真空包裝,，板條可以拆卸,，拆開以后如一次不能用完，請放入提供的密封袋中,，放入干燥劑,，2-8℃保存，在一個月之內仍然有效,。試劑不能反復凍融,。

4．需要而未提供的試劑和器材

1．37℃恒溫箱。

2．標準規(guī)格酶標儀,。

3．精密移液器及一次性吸頭

4．雙蒸水或超純水

5．干凈的試管或Eppendof管

6．吸水紙

7．自動洗板機或8道排槍

8．ELISA數據處理軟件,，推薦使用ELISACalc

9．500ml燒杯的和適當量程的量筒

5試劑準備

a.     使用前所有試劑應置于室溫平衡至少30分鐘。

b.     本試劑盒可以直接加樣,，如濃度過高,，可以進行適當比例的稀釋（推薦2-5倍稀釋），計算時應將結果乘以稀釋的倍數,。

c.      洗滌液為25倍濃縮液,，使用前將所有洗滌液倒入500ml或1L的燒杯中，用雙蒸水定容到500ml即為工作液,。

d.     標準品的稀釋：取5支干凈的Eppendorf管,，每管加150μl的標準品稀釋液，分別標記上800pg/ml,400pg/ml, 200pg/ml,100pg/ml,50pg/ml.取150μl標準品原液加入標記800pg/ml的管中,，混勻后同樣取出150μl,，加入下一管，以此類推直至zui后一管,。零孔：直接加標準品/樣品稀釋液,。（見下圖）

    原液1600pg/ml     800pg/ml    400pg/ml    200pg/ml     100pg/ml    50pg/ml

6樣本前處理

a.標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行,，提取后應盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融,。
b.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清,，保存過程中如出現沉淀，應再次離心,。
c.血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心。
d.尿液：用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心,。胸腹水、腦脊液參照實行,。
e.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清,。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,，以使細胞破壞并放出細胞內成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心。
f.組織標本：切割標本后,，稱取重量,。加入一定量的PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?span lang="EN-US">2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清,。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用。

7洗板方法

a.     手工洗板：先洗去酶標孔中的的液體,，在吸水紙上拍干,，然后每孔加入300μl稀釋好的洗滌液,，輕輕搖晃30秒，然后甩掉,，在吸水紙上拍干,，重復4-5次。

b.     洗板機洗板：洗板機洗板比較便捷,，但應操作熟練后使用,。

8詳細操作程序

a.     使用前請先將試劑盒在室溫下平衡半小時。

b.     空白孔不加樣,，只加顯色劑A,，B和終止液用于調零。

c.      標準品孔：每孔加入稀釋好的標準品50μl,，零孔加入標準品/樣品稀釋液50μl,，然后加入酶標試劑50μl。

d.     樣品孔：加入樣品50μl（推薦直接加樣,，濃度高可以用樣品稀釋液稀釋2-5倍）,，然后加入酶標試劑50μl。

e.      輕輕搖晃,，蓋上封板膜,，37℃培養(yǎng)箱中孵育60min。

f.       將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水25倍稀釋后備用,。

g.    洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復5次,，拍干,。

h.    顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色10分鐘。

i.       終止：每孔加終止液50μl,，終止反應（此時藍色立轉黃色）,。

j.     測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應在加終止液后10分鐘以內進行,。

k.    計算：根據濃度和OD值算出標準曲線的回歸方程，建議用計算軟件進行計算，推薦使用ELISAcalc進行計算,，擬合模型選用logistic曲線（四參數）,。標曲示意圖如下：

9操作總結

準備試劑，樣品和標準品

加入準備好的樣品和標準品,，酶標試劑,，37℃反應60分鐘

洗板5次，加入顯色液A,、B,，37℃顯色10分鐘

加入終止液

10分鐘之內讀OD值

計算

10性能參數

a.     批內差：CV＜10%

b.     批間差：CV＜12%

c.      靈敏度：5pg/ml

d.  保存：    2-8℃

e.  規(guī)格：    96T/盒

f.  有效期：  6個月（2-8℃）。