利用玻璃微珠裂解酵母細(xì)胞

來(lái)源：上海寶葉生物科技有限公司 2012年10月08日 09:17

裂解酵母菌的方法是將玻璃微珠和菌細(xì)胞一起渦旋振蕩進(jìn)行機(jī)械破碎,。此法充分利用玻璃微珠的快速轉(zhuǎn)動(dòng)撞擊酵母菌從而機(jī)械破碎裂解酵母細(xì)胞。由此可見(jiàn),，這是一種強(qiáng)有力的裂解方法,，但在裂解過(guò)程中又傳輸大量的能量,，導(dǎo)致樣本的變性。因此,，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究比較,，酵母菌的免疫沉淀試驗(yàn)并不是一個(gè)好的方法，特別是研究蛋白質(zhì)的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)時(shí),，該方法是不可取的,。

1．準(zhǔn)備工作

由于免疫沉淀有多個(gè)步驟，且包括數(shù)小時(shí)孵育,，因此在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前必須安排好時(shí)間,，注意適當(dāng)利用過(guò)夜孵育的間隙。這將有助于決定何時(shí)開(kāi)始裂解細(xì)胞,。同時(shí)應(yīng)注意,，

酵母菌免疫沉淀的本底水平非常高，因此推薦進(jìn)行預(yù)處理和使用蛋白酶,。

2．所需溶液

PBS,，裂解緩沖液（含有蛋白酶抑制劑，置冰上預(yù)冷）,，玻璃微珠（500umol／L，冷藏）,。

3．操作步驟

（1）4000g離心5min收集酵母菌,，去上清液。重懸浮于PBS,，離心,，棄去PBS。

（2）將酵母團(tuán)再次懸浮于少量預(yù)冷的裂解液,。通常用大約3倍體積的RIPA緩沖液（150mmol／L NaCl,、1％NP-40、0．5％脫氧膽酸鈉,、0．1％SDS和50mmol／L Tris,，pH8．0）,。同時(shí)應(yīng)加入蛋白酶抑制劑。置冰上,。

（3）玻璃微珠（直徑500~mol／L）,，用1mol／I鹽酸和裂解緩沖液分別洗滌2次。然后置于少量裂解緩沖液內(nèi),，413保存,。

（4）在重懸浮的酵母細(xì)胞內(nèi)加入等體積預(yù)冷的玻璃微珠。

（5）劇烈渦流振蕩30s,，重復(fù)操作直至大部分酵母細(xì)胞裂解,。

（6）將細(xì)胞裂解物連同玻璃微珠以10 000g離心5min。仔細(xì)吸取上清液盛于另一試管,，置冰上,。

此時(shí)，上清液可以用于下一步預(yù)處理,。

4．常見(jiàn)問(wèn)題

該方法常見(jiàn)問(wèn)題是蛋白質(zhì)抗原的變性,。解決方法是用某些能破壞細(xì)胞壁的酶處理酵母菌使其形成原生質(zhì)體，然后再用去污劑將其裂解,。這是一個(gè)有效的方法,，但酶的價(jià)格昂貴，限制了該方法常規(guī)應(yīng)用于大容量標(biāo)本的制備,。然而對(duì)于所研究的關(guān)鍵蛋白的精細(xì)分析,，仍不失為一個(gè)有效的方法。

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