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正常骨內(nèi)成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)
人類正常細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)材料：
1. 骨組織來(lái)源：新生或胚胎大鼠,、兔,、人類胚胎或手術(shù)切除之骨組織,；
2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素,、100μg/ml鏈霉素,，pH7.2；
3. 消化液：0.25%胰蛋白酶溶液,，1mg/mlⅡ型膠原酶溶液,；
4. 培養(yǎng)液：RPMI 1640培養(yǎng)基，配制培養(yǎng)液時(shí)加入15%的小牛血清,，并用5.6% NaHCO3 調(diào)節(jié)至pH 7.2,。
人類正常細(xì)胞株
1. 取生后1—2d大鼠若干只，拉頸處死后投入盛有75%乙醇的容器內(nèi)消毒3—5min,。取出置于消毒培養(yǎng)皿中,；
2. 用手術(shù)剪剪開(kāi)頭頂部皮膚，取顱蓋骨（扁骨）,，放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中,。去除骨膜及周?chē)Y(jié)締組織，再用緩沖液洗2次,；
3. 將洗好的顱蓋骨片置于含少量小牛血清的培養(yǎng)皿中剪碎成1mm×1mm大小的骨片植塊,；
4. 將骨片植塊直接接種于25ml螺旋口培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。也可在接種前,，先用1mg/mlⅡ型膠原酶溶液消化植塊15—20min,，經(jīng)緩沖液清洗2次以除去消化液，加少量小牛血清于培養(yǎng)皿內(nèi),，再將侵于小牛血清中的骨片植塊接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),。為了便于細(xì)胞鑒定,，可在接種時(shí)將消毒蓋玻片條置于植塊周?chē)?/div>
5. 反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使種植有植塊的一面朝上,。加入3ml左右的培養(yǎng)液,，蓋好螺旋蓋，但不擰得過(guò)緊,，以利于與外界進(jìn)行氣體交換,。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2 ,、飽和濕度的CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；
6. 2h后，植塊黏附較為牢固,，此時(shí)輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,，使組織塊浸沒(méi)于培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng),。間隔3d換液一次,。
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