神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)

來源：通派（上海）生物科技有限公司 2012年09月20日 17:45

神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)

一、神經(jīng)干細(xì)胞的分離和傳代細(xì)胞

無菌條件下取新生SD大鼠（出生48h內(nèi)）腦組織,，D-Hanks液充分漂洗后,，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，準(zhǔn)確分離海馬,，用眼科剪將海馬剪碎后,，再轉(zhuǎn)移到DMEM/F12（1:1）加B27 和bFGF（20ng/ml）的無血清培養(yǎng)基，吸管吹打機(jī)械分離制作單細(xì)胞懸液,，臺盼藍(lán)染色后細(xì)胞計數(shù),，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104~5個/ml，置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),，每孔加入細(xì)胞懸液500μl,。待神經(jīng)球形成后再次機(jī)械分離克隆制作單細(xì)胞懸液，仍以5×104個/ml的細(xì)胞濃度置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),，每孔加入細(xì)胞懸液500μl,。此后每7d機(jī)械分離克隆傳代1次，方法同前,。

二,、BrdU標(biāo)記

將BrdU溶于無血清培養(yǎng)基，過濾除菌后加入神經(jīng)球形成后再次機(jī)械分離克隆制作的單細(xì)胞懸液中（BrdU終濃度為5μmol/L），培養(yǎng)7d待新的神經(jīng)球形成后,，將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中,，貼壁2h行BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

三,、神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

選取部分上述傳代后形成的次代神經(jīng)球種植于預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中,，并加入有血清培養(yǎng)基（含10％胎牛血清的DMEM/F12），一部分神經(jīng)球于貼壁2h后行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色,，另一部分神經(jīng)球繼續(xù)培養(yǎng),，觀察其生長分化情況。另將一部分次代神經(jīng)球機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液后加入有血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng),，7d后分別行Tuj1 ,、GFAP 、Galc 免疫細(xì)胞化學(xué)染色,。

四,、條件培養(yǎng)液的制備

取1g雞胚的后肢骨骼肌組織，加入9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min,，離心獲得上清液,，過濾除菌后，加兩倍體積DMEM/F12培養(yǎng)基制成條件培養(yǎng)液備用,。

五,、神經(jīng)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化

將一部分次代神經(jīng)球機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液后分別加入條件培養(yǎng)液和有血清培養(yǎng)基（含10％胎牛血清的DMEM/F12）中對照貼壁培養(yǎng)，7d后均行ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色,。

六,、免疫細(xì)胞化學(xué)染色

培養(yǎng)細(xì)胞用4％多聚甲醛固定30min后，PBS充分漂洗,，然后按ABC法分別行鼠抗Nestin,，鼠抗Tuj1，兔抗GFAP,，鼠抗Galc,，鼠抗Brdu免疫細(xì)胞化學(xué)染色，用DAB和H2O2作為呈色劑,，陽性著色為棕黃色。具體方法為：

（1） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（2） 0.3%H2O2/0.05M PBS室溫 30min

（3） 0.3%Triton-100/0.05M PBS 37 ℃,，15min

（4） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（5） 5%羊血清/0.05M PBS 37 ℃,，15min

（6） I抗（2%羊血清/0.05M PBS配） 4℃，48h

（7） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（8） II抗（2%羊血清/0.05M PBS配,，1：200） 37 ℃,，1.5h

（9） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（10） AB復(fù)合物（0.05M PBS配，1：100） 37 ℃，1.5h

（11） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（12） Tris-HCl緩沖液 37 ℃,，15min

（13） DAB顯色 20min

（14）蒸餾水漂洗 10min×3次

然后,，為進(jìn)一步證明實驗組的細(xì)胞是膽堿能神經(jīng)元，將已作完ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色的細(xì)胞用PBS終止顯色以及進(jìn)一步封閉非特異性結(jié)合位點后,，仍用ABC法行Tuj1免疫細(xì)胞化學(xué)染色,，用含有NiCl的DAB和H2O2作為呈色劑,雙標(biāo)陽性細(xì)胞著色為藍(lán)黑色。

相關(guān)產(chǎn)品

免責(zé)聲明

凡本網(wǎng)注明“來源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品,，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品,。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用，并注明“來源：化工儀器網(wǎng)”,。違反上述聲明者,，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源（非化工儀器網(wǎng)）的作品,，目的在于傳遞更多信息,，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負(fù)責(zé)，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任,。其他媒體,、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任,。
如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,，請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。

神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)

免責(zé)聲明

聯(lián)系我們

關(guān)注我們