細胞復(fù)蘇步驟注意事項：

【材料】1.常規(guī)細胞培養(yǎng)儀器設(shè)備恒溫水浴振蕩器,。

2.培養(yǎng)液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亞砜（DMSO）【操作程序】1.細胞實驗室進行常規(guī)消毒,，紫外照射40min以上。2.培養(yǎng)液（DMEM）,、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預(yù)熱20min,，備用。

3.二甲基亞砜（DMSO）在40C冰箱中冷藏30min,，備用,。

4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400C水浴中,，快速搖晃,，直至凍存液*融化。

5.將細胞懸液移入15ml離心管,，緩慢加入4ml培養(yǎng)液,，離心（1000r/min，5min）,。

6.用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞,，調(diào)整細胞濃度，方培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

7.記錄復(fù)蘇日期,。

【注意事項】1.取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡,。此項尤為重要,，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升,，可導(dǎo)致爆炸,。

2.凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述,，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是*無毒副作用,，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作較大,，因此,，必須在1-2min內(nèi)使凍存液*融化。如果復(fù)蘇溫度太慢,，會造成細胞的損傷,，二甲基亞砜（DMSO）選擇進口產(chǎn)品。

3.離心前須加入少量培養(yǎng)液,。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高,，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷,。

4.離心問題：目前主要有兩種見解,。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng),，第二天換液。因為離心的目的是兩個,，去除DMSO,，去除死細胞，這個是標準流程,，但對一般人來說,，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時間，轉(zhuǎn)的不夠活細胞沉底的少,，細胞就全被扔掉了,，轉(zhuǎn)過了活細胞會受壓過大，死亡,。此外在操作過程中容易污染,，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO）,，DMSO對細胞有一定的毒副作用,，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈,。我在試驗中按照常規(guī)的離心分裝的方法進行復(fù)蘇,，結(jié)果無有異常,。

5.細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液,，而在我的試驗中的經(jīng)驗總結(jié)為培養(yǎng)基越少細胞越容易貼附。

6.復(fù)蘇細胞分裝的問題：試驗中我的經(jīng)驗總結(jié)為復(fù)蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中,，分裝過多,，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁,。7.加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度,，從如果你加培養(yǎng)基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大,，就會影響細胞生長,，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候?qū)σ话慵毎麤]有什么影響,，還有一個說法是1％,。所以如果你的凍存液的濃度是10％DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。一,、原理在不加任何條件下直接凍存細胞時,，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷,、電解質(zhì)升高,、滲透壓改變,、脫水、PH改變,、蛋白變性等,，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑,，可使冰點降低,。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細胞,。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成,。