TCA沉淀——過(guò)濾法

1．為了檢測(cè)放射性標(biāo)記物結(jié)合蛋白質(zhì)的摻入量,，每個(gè)樣本吸取一定量（通常為5／／1）加入盛有100t~lBSA溶液（1mg／m1）的1．5m1錐形管中。
2．每管加入lmll0％冰冷的三氯醋酸,，混勻,。
3．冰上孵育30min,。
4．將玻璃纖維濾紙置于一適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾器上,，用少量的10％三氯醋酸真空過(guò)濾,，預(yù)先濕潤(rùn)濾紙。
5．滴加樣本于濾紙的中央,，而末摻入標(biāo)記物則通過(guò)濾紙除去,，被TCA沉淀的蛋白質(zhì)則吸附在濾紙上。
6．再用少量的10％三氯醋酸（數(shù)毫升）洗滌2次,。
7．用少量的95％乙醇洗滌2次,。
8．取下濾紙并讓其干燥。將濾紙放在一張鋁箔上,，用紅外線(xiàn)燈照射加速其干燥,。將干燥的濾紙放入測(cè)量瓶中，加入閃爍液,，計(jì)數(shù)cpm,。
注：在三氯醋酸中加入非放射性標(biāo)記的分子可降低檢測(cè)的本底。例如氯醋酸中加入蛋氨酸可降低[35S]蛋氨酸的本底,。

TCA沉淀——斑點(diǎn)法

1．為了檢測(cè)放射性標(biāo)記物結(jié)合蛋白質(zhì)的摻入量,，每個(gè)樣本吸取一定量（通常為5ul）與5ulBSA（10mg／m1）溶液混合。
2．將混合后的樣本滴在干燥的玻璃纖維濾紙中央,，將濾紙片放在一淺盤(pán)或培養(yǎng)皿中,。注意濾紙片在使用前應(yīng)作好標(biāo)記。
3．小心地用10％冷三氯醋酸（TCA）淹沒(méi)濾紙片
4．在冰上或4℃孵育30min．
5．吸出平皿內(nèi)的三氯醋酸,，再加入新鮮的10％冷三氯醋酸,，室溫下孵育5min，期間不斷震蕩,。再吸出三氯醋酸并重復(fù)2次,。
6．吸出平皿內(nèi)的三氯醋酸，再加入95％乙醇,，室溫下孵育5min,，期間不斷震蕩。
7．取出濾紙片并讓其干燥,。將濾紙片放在一張鋁箔上,，用紅外線(xiàn)燈照射加速其干燥。將干燥的濾紙片放入測(cè)量瓶中,，加入閃爍液,，計(jì)數(shù)cpm。
注：在三氯醋酸中加入非放射性標(biāo)記的分子可降低檢測(cè)的本底,。例如,，在三氯醋酸中加入蛋氨酸可減低[35S]蛋氨酸的本底。www.shjsbio.com