封閉劑在細(xì)胞免疫熒光中的應(yīng)用

一,、固定：

PBS 5min×3次 振蕩洗滌制作好的細(xì)胞爬片。

固定液覆蓋細(xì)胞,，RT 靜置15min,。

PBS 5min×3次 振蕩洗滌。

二,、通透化：

通透液覆蓋細(xì)胞,，RT 靜置30min。

PBS 5min×3次 振蕩洗滌,。

三,、封閉：

封閉液覆蓋標(biāo)本表面37℃孵育1h。

四,、一抗孵育：

一抗以合適濃度稀釋PBS,，覆蓋標(biāo)本表面。

4℃孵育過夜,，第二天37℃復(fù)溫1h,。

PBS 5min×3次 振蕩洗滌。

五,、二抗孵育：

FITC標(biāo)記二抗以合適濃度稀釋于PBS,，覆蓋標(biāo)本表面。

37℃避光孵育<60min,。

PBS 5min×3次 避光 振蕩洗滌,。

六、染核：

新鮮稀釋Hoechst覆蓋細(xì)胞表面,，RT避光靜置<10min,。

PBS 5min×3次 避光 振蕩洗滌。

七,、封片：

在干凈的載玻片上滴一滴封片劑,，將爬片的細(xì)胞面扣在封片劑上。

八,、鏡檢,，4℃避光保存。

II,、注：

1,、細(xì)胞密度要合適，狀態(tài)較好,。

2,、從孵育二抗開始要避光（關(guān)閉室內(nèi)日光燈即可）。

3、完成后及時鏡檢,，照相;分別用不同波長激發(fā)熒光,，在Photoshop軟件下合成一張圖。

III,、試劑配制：

1,、固定液：4%多聚甲醛/PBS：

4g多聚甲醛，50～80mlPBS,，加熱至60℃,，持續(xù)攪拌至*溶解，（通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮）,，定容100ml,，RT保存。

2,、通透液：0.5 %（v/v）TritonX-100/PBS

3,、封閉液：正常山羊血清稀釋于PBS;或商品化封閉液成品。

4,、Hoechst：Hoechst33258即可,。

5、封片劑：50%（v/v）甘油/PBS,。
 

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