背景：皰疹病毒(herpes virus)是一群有包膜的DNA病毒，生物學(xué)特性相似,，歸類為皰疹病毒科(Herpesviridae)。其感染宿主廣泛，主要侵害皮膚,、黏膜以及神經(jīng)組織，嚴(yán)重影響著人及其他動物的健康,。馬可能感染多種皰疹病毒,。最常見的與感冒病毒相似，易致呼吸困難,。馬皰疹病毒4型(EHV-4)也稱馬鼻肺炎病毒,，主要引起呼吸系統(tǒng)疾病。因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。

產(chǎn)品及特點(diǎn)    

本產(chǎn)品是根據(jù)探針法熒光定量 PCR 原理開發(fā)的檢測試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物等組分經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏度高,。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品,。

4. 特異性高,，引物是根據(jù)中間普雷沃菌 DNA 序列高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會跟其他生物樣本的DNA發(fā)生交叉反應(yīng),。

5. 既可用于定性檢測,，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級,。

6. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng),。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研

使用方法：

一、DNA 提取(樣本制備區(qū))

用自選方法提取純化樣品DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容,。

二、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(樣本制備區(qū))

 （由于陽性對照濃度高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，避免污染樣品或本試劑盒的其他成分）。

1. 標(biāo)記6個離心管,，分別為7,，6，5,，4,，3，2,。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL DEPC-H2O,，（最好用帶芯槍頭，下同）,。

3.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

4.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

5.換槍頭,，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

6.重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

若無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,，將陽性對照稀釋到1×10E5拷貝/μL即可。

三,、試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

若有N個待檢樣品，準(zhǔn)備N+2個qPCR管(N個待檢樣品+1個陰性對照+6個陽性對照),，向各PCR管中分別加入下列成分(見詳細(xì)說明書,，可向我司索取)

轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)。

四,、添加模板(模板添加區(qū))

向qPCR管中分別加入2ul模板,，加樣順序?yàn)殛幮詫φ眨―EPC-H2O）、待測樣品模板,、嬰兒利什曼蟲qPCR陽性對照,，離心30秒，立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),。

五,、擴(kuò)增反應(yīng)(擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū))

將PCR管放置在PCR擴(kuò)增儀器樣品槽相應(yīng)位置，進(jìn)行擴(kuò)增,，擴(kuò)增程序如下：(見詳細(xì)說明書,，可向我司索取)

六、結(jié)果分析

1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,，則以陽性對照濃度的log 值為橫軸,，以Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的log 值,，推算出其濃度。

2. 如果未制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,，按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：

陽性對照結(jié)果：Ct 值<30,，有明顯指數(shù)增長，呈典型的S 型曲線,。

陰性對照結(jié)果：Ct 值>38 或無Ct 值,，無明顯指數(shù)增長期和平臺期,。

樣本檢測結(jié)果：Ct 值<35，有明顯指數(shù)增長,，表明樣本中檢測出嬰兒利什曼蟲,，結(jié)果為陽性；Ct 值>38 或無Ct 值,，表明樣本中未檢測出嬰兒利什曼蟲,，結(jié)果為陰性；Ct值在35-38 范圍,，應(yīng)對樣本進(jìn)行復(fù)檢,，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct 值仍在35-38 范圍，有明顯指數(shù)增長,，則判定為陽性,，否則為陰性。

運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸,，-20℃保存,，保存期限為一年。陽性對照需要單獨(dú)放置,，不要污染其他試劑,。