熒光分子在生物研究中的應(yīng)用是許多應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，并且由于其具有多功能性,、靈敏度和定量能力,，其用途在不斷增加。在眾多用途中,，熒光探針用于檢測蛋白位置和活化,，識別蛋白復(fù)合物形成和構(gòu)象改變以及監(jiān)測體內(nèi)的生物過程。使用免疫熒光方法來展現(xiàn)這張代表性圖像,。

使用熒光基團偶聯(lián)抗體檢測靶蛋白,。小鼠皮層神經(jīng)元中的突觸素（紅色）和微管相關(guān)蛋白 2（MAP2；綠色）分別使用特異性一抗和 Thermo Scientific DyLight 650 偶聯(lián)的山羊抗家兔或 DyLight 488-Goat 抗小鼠二抗進行熒光標(biāo)記,。均使用 Hoechst 染料標(biāo)記兩面板中的細胞核,。

本頁內(nèi)容

· 熒光介紹

· 熒光基團種類

· 熒光檢測和定量

· 熒光標(biāo)記

· 影響熒光發(fā)射或檢測的因素

熒光介紹

熒光的機制

熒光分子也稱為熒光基團或簡單稱為熒光體，與其他分子相比，它對光具有明顯響應(yīng),。如下文所示,，激發(fā)光光子被熒光微球的電子吸收，從而將電子的能量水平提高到激發(fā)狀態(tài),。在這一短暫的激發(fā)期內(nèi),，部分能量會通過分子碰撞消散或轉(zhuǎn)移到近端分子，剩余的能量會作為光子發(fā)射,，從而讓電子恢復(fù)其基態(tài),。由于發(fā)射的光子通常攜帶更少的能量，因此波長比激發(fā)光子更長,，從而將發(fā)射熒光與激發(fā)光相區(qū)分。熒光基團的激發(fā)和光子發(fā)射具有周期性,，且直至熒光基團發(fā)生不可逆地受損（參見見下文的光子漂白）前,，其可重復(fù)激發(fā)。因此熒光基團可以通過該激發(fā)和發(fā)射周期發(fā)射許多光子,，可用于多種研究應(yīng)用,。

熒光的 Jablonski 能量圖。

熒光光譜

激發(fā)和發(fā)射波長都是每種熒光基團的特異性特性,，雖然這些波長與單原子熒光基團處于離散狀態(tài),，但多原子熒光基團表現(xiàn)出廣泛的激發(fā)和發(fā)射光譜。在 X-Y 圖上繪制熒光分子（單原子和多原子）光譜,，表明與每個熒光基團的最大和最小激發(fā)和發(fā)射信號強度相對應(yīng)的波長,，如下圖（左圖）所示。請注意,，由于在發(fā)射前存在部分能量損失,，盡管發(fā)射波長與激發(fā)波長無關(guān)（如上所示），但發(fā)射強度與激發(fā)波長的振幅成正比,，如下圖（右圖）(2) 中的激發(fā)能量（Ex 1 和 Ex2）及其相應(yīng)的發(fā)射強度（分別為 Em1 和 Em2）所示,。

熒光基團的激發(fā)和發(fā)射光譜以及激發(fā)振幅和發(fā)射強度之間的相關(guān)性。熒光基團激發(fā)和發(fā)射光譜的總圖（左）,。發(fā)射光的強度（Em1 和 Em2）與激發(fā)任何激發(fā)波長（分別為 Ex1 和 Ex2,；右）的熒光基團所需的能量成正比。

斯托克斯位移

激發(fā)和發(fā)射波長之間的距離稱為斯托克斯位移（參見下文）,，是生物學(xué)應(yīng)用中檢測發(fā)射熒光的關(guān)鍵方面,。斯托克斯位移也是每個熒光基團的明顯特征。例如,，當(dāng)使用斯托克斯位移很小的熒光基團（右圖）時,，對發(fā)射熒光進行檢測可能很難區(qū)分激發(fā)光，因為激發(fā)和發(fā)射波長在較大程度上存在重疊。相反,，由于激發(fā)波長與發(fā)射波長之間存在很大分離,，很容易區(qū)分具有較大斯托克斯位移的熒光基團（左圖）。斯托克斯位移在多通路熒光應(yīng)用中尤為關(guān)鍵,，因為一個熒光體的發(fā)射波長可能會重疊,，因此會激發(fā)同一樣品中的另一個熒光體。

熒光基團激發(fā)和發(fā)射光譜的斯托克斯位移,。具有較高斯托克斯位移的熒光基團（左）顯示樣品中激發(fā)光和發(fā)射光之間存在清晰區(qū)分,，而對于斯托克斯位移較小的熒光基團（右），由于激發(fā)和發(fā)射波長之間的差異較小,，則顯示更高的背景信號,。

顏色范圍

電磁頻譜指各種電磁輻射波長的較大范圍，可見光光譜僅限于這些波長中極小的子集,，如下所示,。由于對超出可見光譜進行檢測時存在限制，因此基于熒光的早期研究應(yīng)用采用僅在電磁光譜可見光范圍 (390 – 700 nm) 中發(fā)射的熒光基團,。依賴于如今的技術(shù)進步,，人們能夠檢測出可見光譜邊界以外的熒光基團，并檢測到電磁光譜的紫外 (UV) 和紅外 (IR) 范圍,。這些新型熒光基團和檢測器為全新和開發(fā)的應(yīng)用提供了更出色的可變性,、多功能性和多重檢測能力。

指示近似波長的可見光光譜,。

熒光基團亮度

特定熒光基團的亮度由摩爾消光系數(shù)和量子產(chǎn)率確定,，兩者均具有特異性。摩爾消光系數(shù) (ε) 定義為在給定波長下可以被熒光吸收的光量（測量單位：M^-1 cm^-1）,。量子產(chǎn)率 (Φ) 的計算方式為熒光發(fā)射的光子數(shù)量除以吸收的光子數(shù)量,。熒光基團亮度的計算方式為將 ε 和 Φ 相乘。

熒光基團種類

盡管熒光化學(xué)以及技術(shù)發(fā)現(xiàn)的發(fā)展推動了多種不同類型熒光基團的開發(fā),，但近 100 年來的生物研究仍然使用了熒光,。大量的熒光基團可以為研究應(yīng)用提供比以往任何時候更高的靈活性、變異性和熒光基團性能,。熒光染料可分為三組通用組：

· 有機染料

· 生物熒光基團

· 量子點

每個熒光基團都具有不同的特征,，在決定使用哪種熒光基團用于給定的應(yīng)用或?qū)嶒炏到y(tǒng)時，應(yīng)考慮這一點,。

有機染料

熒光素等合成有機染料,，是生物學(xué)研究中使用的熒光化合物。已對此類原始化合物的衍生物進行加工,，以提高其光穩(wěn)定性和溶解度,。還針對此類染料開發(fā)了衍生物,，用于生物偶聯(lián)，特別是異硫氰酸熒光素 (FITC),、羅丹明（四甲基羅丹明異硫氰酸鹽,，TRITC）和具有更高性能的市售類型。對于生物偶聯(lián)策略而言,，這些熒光體的小尺寸是優(yōu)于生物偶聯(lián)熒光基團的優(yōu)勢,，因為它們可以與抗體、生物素或親和素大分子交聯(lián),，而不會干擾正常的生物學(xué)功能,。具有特征激發(fā)/發(fā)射光譜和量子產(chǎn)率和激發(fā)系數(shù)的多種染料，可市售用于任何熒光應(yīng)用,。

生物熒光基團

雖然人們已在千年前了解到存在生物發(fā)光,，但研究應(yīng)用中的生物熒光基團的使用發(fā)生在 1990 年代，當(dāng)時綠色熒光蛋白 (GFP) 由維多利亞多管發(fā)光水母克隆而來,，作為基因表達報告基因 (3),。自此，原 GFP,、藻膽蛋白（別藻藍蛋白、藻青蛋白,、藻紅蛋白和藻膽蛋白）以及許多其他蛋白均被設(shè)計用于生物表達系統(tǒng),，它們的使用現(xiàn)在在生物研究中已經(jīng)十分常見。

這類熒光基團的優(yōu)點在于可將表達質(zhì)粒引入細菌,、細胞,、器官或全生物中，以驅(qū)動該熒光基團單獨表達或在研究的生物過程背景下融合至目標(biāo)蛋白的表達,。使用熒光蛋白可能很耗時,，表達將大量產(chǎn)生光蛋白，該蛋白可能會產(chǎn)生活性氧簇,，并誘導(dǎo)實際反應(yīng)或毒性,。此外，熒光蛋白的大小可以改變熒光基團融合到的細胞蛋白的正常生物學(xué)功能,，生物熒光基團通常不會具有合成熒光染料所具有的光穩(wěn)定性和靈敏度水平,。

量子點

量子點是具有化學(xué)特性的納米晶體，可嚴格控制熒光體的光譜特性,。量子點于 1980 年代開發(fā),，自 1990 年代以來，已越來越多地用于生物研究的熒光應(yīng)用,。量子點是納米級尺寸 (2-50 nm) 的半導(dǎo)體,，在激發(fā)時，會根據(jù)顆粒的大小發(fā)射某一波長的熒光；相較于大量子點,，較小的量子點會發(fā)射更高的能量,，因此隨著納米晶體尺寸的增加，發(fā)射光從藍色轉(zhuǎn)換為紅色,。由于量子點大小可以嚴格控制,，因此與其他熒光體相比，對于不同的激發(fā)和發(fā)射波長具有更高的特異性,。 

使用 Qdot 二抗偶聯(lián)物進行多色免疫熒光成像小鼠腎層粘連蛋白被標(biāo)記上抗層粘連蛋白一抗,，用綠色熒光素 Qdot 565 IgG 顯色。血小板/內(nèi)皮細胞黏附分子（PECAM 又名 CD31）被標(biāo)記為抗 PECAM-1一抗,，用紅色熒光 Qdot 655 IgG 顯色,。細胞核使用藍色熒光素 Hoechst 33342 染色

據(jù)報告，量子點比其他熒光基團更具光穩(wěn)定性,，因為一份報告顯示,，量子點在可在體內(nèi)成像研究中保持 4 個月的熒光狀態(tài) (1)。此外,，量子點可以包被用于蛋白標(biāo)記等不同生物學(xué)應(yīng)用,。雖然在生物應(yīng)用中對量子點的使用處于上升狀態(tài)，但由于顆粒的分解 (4),，據(jù)報告存在細胞毒性,，并且其使用成本過高。

熒光檢測和定量

檢測策略

我們開發(fā)了多種不同類型的熒光檢測儀器,，雖然每種儀器僅適用于都不同的實驗方法,，但所有熒光檢測儀器都具有四種基本要求：

· 激光、光電二極管或燈（氙弧燈和汞蒸汽燈最為常見)等激發(fā)光源

· 熒光基團

· 用于分離特定波長以激發(fā)不同熒光基團的濾光片

· 記錄輸出（通常是電子信號）的探測器

雖然此列表并不詳盡,，并且我們還在不斷開發(fā)新儀器,，但常見的熒光檢測儀器包括以下儀器：

· 熒光顯微鏡 – 檢測樣品二維和三維的局部熒光劑

· 微陣列讀數(shù)儀等熒光掃描儀 – 檢測樣品在兩維的局部熒光劑

· 分光光度計和酶標(biāo)儀 – 記錄樣品中的平均熒光

· 流式細胞儀 – 分析樣品群中單個細胞的熒光

定量

隨著數(shù)字顯微鏡的出現(xiàn)，已能夠在在所有熒光應(yīng)用中普遍發(fā)現(xiàn)熒光信號定量的存在,，并且能夠測量以下各種參數(shù)：

· 細胞計數(shù)

· 定位于細胞或甚至離散細胞區(qū)室的熒光基團量

· 基因表達率和蛋白合成率

· 細胞運動速率或細胞內(nèi)組分的移動速率

· 樣品中的 DNA 量,、RNA 量或蛋白量

· DNA、RNA 或蛋白序列

· 酶活性

· 存活率

根據(jù)實驗方法,，熒光定量需要專用軟件,，可能需要熒光標(biāo)準(zhǔn)品來校準(zhǔn)儀器。

熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記是將熒光基團共價連接到其他蛋白或核酸等分子的過程,。這通常通過使用熒光基團的反應(yīng)性衍生物實現(xiàn),，該熒光基團可選擇性地與靶分子中的官能團結(jié)合。最常標(biāo)記的分子是抗體,，抗體可用作檢測特定靶標(biāo)的特異性探針,。熒光標(biāo)記可應(yīng)用于各種檢測系統(tǒng),，并可以進行靈敏和定量測量。

熒光基團偶聯(lián)

標(biāo)記分子需要熒光基團的化學(xué)反應(yīng)性衍生物,。常見反應(yīng)性基團包括胺反應(yīng)性異硫氰酸鹽衍生物,，包括 FITC、胺反應(yīng)性琥珀酰亞胺酯,，例如 NHS 熒光素或 NHS 羅丹明以及巰基反應(yīng)性馬來酰亞胺活化熒光劑（例如：熒光素-5-馬來酰亞胺）,。這些反應(yīng)性染料與另一種分子的反應(yīng)可形成熒光基團與標(biāo)記分子之間的穩(wěn)定共價鍵。異硫氰酸酯長期以來一直用作主要反應(yīng)性化學(xué)試劑,，通過賴氨酸側(cè)鏈的一級胺將熒光染料與蛋白連接,。NHS 酯化學(xué)試劑現(xiàn)在是標(biāo)記方法，因為其對一級胺具有更高的特異性,，并在標(biāo)記程序后產(chǎn)生更穩(wěn)定的鍵,。巰基反應(yīng)性化學(xué)組成在蛋白質(zhì)標(biāo)記中的應(yīng)用范圍較小，主要適用于需要保留賴氨酸殘基或特異性靶向半胱氨酸殘基以在標(biāo)記蛋白上定位熒光染料的情況,。

NHS 熒光素和 FITC 的結(jié)構(gòu),；熒光素的兩種胺反應(yīng)性衍生物。

NHS 光素通過 N羥基琥珀酰亞胺（NHS 酯）官能團激活,。與 FITC 相比,，NHS 衍生物在存在其他親核試劑的情況下對一級胺具有更高的特異性，并在標(biāo)記后產(chǎn)生更穩(wěn)定的鍵,。

NHS 熒光素和 FITC 的比較,。

使用熒光素標(biāo)記的二抗檢測 α 微管蛋白。A549 人肺癌細胞在 96 孔微孔板中生長 18 – 20 小時,，使用 4% 多聚甲醛（貨號：28906）固定，并使用 0.1% Surfact-Amps X-100（貨號：28314）透化處理,。使用小鼠抗 α 微管蛋白一抗 (0.4 μg/mL) 和熒光素山羊抗小鼠二抗 (2 µg/mL) 通過探針對細胞進行探查,。使用 Hoechst 染料對細胞核進行標(biāo)記。圖像通過熒光顯微鏡采集,。A. 熒光圖像顯示了僅位于細胞質(zhì)中的α 微管蛋白（偽彩綠色）的精細網(wǎng)絡(luò),。B. 使用 Hoechst 染料進行核復(fù)染（偽彩藍色）C. 合并圖像。

為檢測熒光信號,，分子必須被充分標(biāo)記,，同時不干擾分子的功能、溶解性,、結(jié)合能力或激活性等正常生物特性,。因此，熒光標(biāo)記需要優(yōu)化,。

去除未反應(yīng)的熒光基團

完成熒光標(biāo)記反應(yīng)后,，通常需要從標(biāo)記的靶標(biāo)分子中去除所有未反應(yīng)的熒光基團,。這通常通過尺寸排除色譜法實現(xiàn)，利用熒光基團,、標(biāo)記蛋白以及核酸等之間的大小差異,。然而，許多熒光基團與常規(guī)的分離基質(zhì)相互作用,，會導(dǎo)致回收率和分離效果不佳,。因此，考慮熒光染料疏水特性的專用染料去除柱,。使用市售染料去除柱,，可以從小至 7kDa、大至 150 kDa IgG 的蛋白中去除染料分子,。

影響熒光發(fā)射或檢測的因素

淬滅

熒光基團發(fā)射可直接受其他熒光或非熒光分子的相互作用影響,，而后者可以"猝滅"激發(fā)熒光基團發(fā)出的熒光。由于可在生物學(xué)事件的響應(yīng)中添加或去除淬滅劑,，因此熒光淬滅通常用于確定蛋白的激活狀態(tài)或識別基因表達,。

淬滅程度取決于淬滅劑分子的性質(zhì)（熒光基團或非熒光基團）、相互作用類型以及熒光體發(fā)射的能量波長,。熒光猝滅的方法包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET),、碰撞猝滅和接觸猝滅，通過以下圖表表示,。

在 FRET（也稱為 F?rster 共振能量轉(zhuǎn)移）中,，激發(fā)光將"供體"熒光體提高到激發(fā)狀態(tài)，從而導(dǎo)致光子釋放,。"受體"分子可以是另一個熒光體或非熒光分子,，與供體熒光體足夠接近，以吸收發(fā)射的光子,，然后在非熒光分子情況下有效淬滅發(fā)射的光,。當(dāng)使用熒光體作為淬滅劑時，發(fā)射的光子也會被淬滅,，并且如果吸收的光子位于第二熒光體的激發(fā)波長范圍內(nèi),，受體電子將被提升至激發(fā)狀態(tài)并在受體熒光體波長處釋放光子。另一種作為淬滅劑的熒光體通常用于檢測供體熒光體的淬滅狀態(tài),，因為熒光體并非在應(yīng)答供體熒光體的激發(fā)時檢測已知波長的熒光,，而是在淬滅熒光體的波長處發(fā)射淬滅熒光。

FRET 光譜重疊積分的示意圖,。該過程是兩種染料分子在電子激發(fā)狀態(tài)下之間的距離依賴性相互作用,，其中激發(fā)作用從供體分子轉(zhuǎn)移至受體分子，而不發(fā)射光子,。

表 1.Forster Radius 的 R0 典型值 – 注意： Forster 中 O 的上方有兩個圓點

接觸猝滅發(fā)生于激發(fā)前熒光基團與淬滅分子復(fù)合時,；由于熒光體與其他分子直接接觸,，激發(fā)產(chǎn)生的能量立即轉(zhuǎn)移到接觸分子，并以熱的形式耗散,。碰撞淬滅發(fā)生于激發(fā)熒光基團與溶液中的淬滅劑反應(yīng)時,，能量立即轉(zhuǎn)移到接觸的分子，激發(fā)熒光體隨之弛豫,。

熒光淬滅類型圖,。

背景熒光

在特定實驗中，熒光基團檢測可能會被高背景熒光干擾,，這通常是由于未清除未結(jié)合的熒光探針或樣品自發(fā)熒光引起,。清洗樣品或減少熒光探針的濃度可以降低背景熒光。但是,，針對自發(fā)熒光問題（定義為樣品中組分的內(nèi)源性熒光）,，需要考慮正確的探針組合或設(shè)備。生物樣品中的自發(fā)熒光通常在使用較短波長激發(fā)光（通常 <500 nm）時發(fā)出,。因此,，可以使用不激發(fā)與樣品相同光譜的熒光體或濾光片組（專用于將激發(fā)光縮小至靶熒光染料的激發(fā)光），從而盡可能減少或避免自發(fā)熒光,。

低熒光

低熒光強度可限制靶熒光基團的檢測,，在背景熒光較高時尤為如此。熒光強度可通過增加靶位點上的熒光分子數(shù)量而增強,。這可以通過在實驗或擴增方法中使用更高濃度的探針來完成,，以增加熒光基團在靶位點的定位。由于增加探針濃度可能會沉淀探針分子并導(dǎo)致細胞畸變（細胞內(nèi)探針則更為嚴重）或自淬滅（因為分子間相互作用水平高,；參見上文“淬滅”部分）或誘導(dǎo)細胞死亡,，因此兩種方法都可以對信號檢測產(chǎn)生負面影響。

除了累積熒光探針數(shù)量外,，由于激發(fā)強度與激發(fā)能量成正比,，有時也可通過增加激發(fā)光強度來增強低熒光強度。但如下文所述,，使用這種方法必須達到平衡,，避免熒光褪色,。

光漂白

光漂白是熒光團基團因長時間暴露在激發(fā)光源下或高強度激發(fā)光下發(fā)生不可逆破壞的現(xiàn)象,。通過將熒光體暴露于可能的極低激發(fā)光強度水平，以盡可能縮短或避免光漂白同時還實現(xiàn)信號檢測,；這需要使用高靈敏度 CCD 相機,、高數(shù)值孔徑物鏡和/或超寬帶帶通發(fā)射濾光片優(yōu)化檢測方法。其他方法包括使用比傳統(tǒng)熒光基團更穩(wěn)定的光基團和/或使用抗淬滅劑保護熒光體免受光漂白,。避免光漂白的步驟并不適用所有檢測方法,，應(yīng)該針對每種方法進行優(yōu)化,。例如，Intifada 試劑對活細胞具有毒性,，因此只能用于固定細胞或組織,。此外，由于熒光基團在激發(fā)源下的曝光時間極短,，因此流式細胞術(shù)等部分檢測方法,，通常無需設(shè)置避免光漂白的步驟。以下示例說明了熒光光光漂白現(xiàn)象,。

Invitrogen Alexa Fluor 488,、Alexa Fluor 546 染料、熒光素和 Cy3 熒光基團針對光漂白率的對比,。牛肺動脈內(nèi)皮細胞 (BPAEC) 的細胞骨架分別使用 Alexa Fluor® 488鬼筆環(huán)肽（上系列）,、小鼠單克隆抗 α 微管蛋白抗體及 Alexa Fluor 546 山羊抗小鼠 IgG 抗體標(biāo)記或熒光素鬼筆環(huán)肽（下系列）、抗 α 微管蛋白抗體及市售的 Cy3 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 抗體標(biāo)記,。偽彩圖像每隔 30 秒拍攝（0,、30、90,、210 秒曝光）,。圖片通過適合熒光素和羅丹明的帶通濾色片獲得。

推薦閱讀：

1. Ballou B. et al.(2004) Noninvasive imaging of quantum dots in mice.Bioconjug Chem.15, 79-86.

2. Encyclopedia of Chromatography: J. Cazes (Ed.); Marcel Dekker Inc., New York, 2001

3. Chalfie M. et al.(1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science.263, 802-5.

4. Mahendra S. et al.(2008) Quantum dot weathering results in microbial toxicity.Environ Sci Technol.42, 9424-30.

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