在熒光定量 PCR 實驗里，無 Ct 值出現(xiàn)和 Ct 值過晚是常讓科研人員頭疼的問題,。這些問題會嚴重干擾實驗結果的準確性與可靠性,，接下來我們就深入探討下背后的原因和解決辦法。

一,、無 Ct 值出現(xiàn)的原因及解決辦法

（一）循環(huán)數(shù)設置不合理  正常情況下，PCR 循環(huán)數(shù)一般不宜超過 45 循環(huán),。要是循環(huán)數(shù)設置不夠,，可能因擴增產物量不夠，熒光信號沒達到可檢測水平,，導致無 Ct 值,。比如在一些低拷貝數(shù)模板的檢測中，若循環(huán)數(shù)只設 30 次,，很可能就檢測不到產物,。

解決辦法：依據(jù)實驗經驗和模板預估量，合理增加循環(huán)數(shù),，不過要注意,，循環(huán)數(shù)過高也會使背景值提高，定量不準,，通常調整到 35 - 40 循環(huán)較為合適,。

（二）PCR 程序里檢測熒光信號步驟有誤  不同熒光定量方法,，采集熒光信號的時機有別。像 SG 法一般在 72℃延伸時采集,，TaqMan 法則多在退火結束或延伸時采集,。要是 PCR 程序設置時，熒光采集步驟和所用方法不匹配,，或者壓根沒勾選熒光采集選項,，那肯定檢測不到熒光信號，也就沒有 Ct 值,。

解決辦法：仔細核對所用熒光定量方法的說明書,，嚴格按要求設置 PCR 程序里熒光信號檢測步驟，確保準確采集熒光信號,。

（三）引物或探針降解  引物或探針降解后，無法正常和模板結合并引導擴增,，自然不會有擴增產物,，也就無 Ct 值?？赏ㄟ^ PAGE 電泳檢測引物和探針是否降解,，降解的引物或探針在電泳圖上會呈現(xiàn)出條帶模糊、拖尾等異常,。

解決辦法：重新合成高質量引物和探針,，注意引物和探針的保存條件，避免反復凍融,，最好小量分裝,，存放在 - 20℃或 - 80℃。

（四）模板降解或上樣量不夠  模板降解,，完整性被破壞,，擴增難以進行；上樣量不夠,，起始模板拷貝數(shù)少,，擴增產物量也會很少，導致熒光信號弱,，檢測不到 Ct 值,。一般模板上樣量不超 500ng，對未知濃度樣本,，應從系列稀釋樣本的最高濃度開始實驗,。另外，樣本準備過程中引入雜質、反復凍融,，都可能造成模板降解,。

解決辦法：優(yōu)化樣本提取和保存方法，確保模板質量,。提取后盡快實驗,，如需保存，將模板樣本小量分裝儲備,，避免反復凍融。實驗前,，用核酸定量儀精確測定模板濃度,，依據(jù)濃度調整上樣量。

（五）引物探針設計不合理  引物設計要是不合理,，像上下游引物 Tm 值差異超 4℃,，會影響擴增效率，甚至導致擴增失敗,，沒有 Ct 值,；引物若不能跨越內含子，擴增基因組 DNA 時,，可能受內含子干擾,，影響結果。

解決辦法：借助專業(yè)引物設計軟件,，如 Primer Premier 5.0 等,，精心設計引物。設計好后,，進行 BLAST 比對,，確保引物特異性，避免與其他基因序列有過多同源性,。

二,、Ct 值過晚的原因及解決辦法

（一）擴增效率低

1. 引物間或引物與探針比例不當：引物和探針濃度不合適，比如引物濃度過高,，可能形成引物二聚體,，競爭模板結合位點，降低擴增效率,；引物和探針比例失衡,，也會影響擴增。

解決辦法：通過預實驗,，優(yōu)化引物和探針濃度及比例,，摸索出最佳反應體系。

2. 引物或探針設計不合理：引物長度,、GC 含量,、特異性等不合適,，都可能致使擴增效率低，Ct 值過晚,。比如引物長度過長,，退火時難以和模板配對，影響擴增,。

解決辦法：重新設計引物和探針,，保證引物長度適中（一般 18 - 25bp），GC 含量在 40% - 60%,，同時具備高特異性,。

（二）PCR 程序不合適

1. 改用三步法反應：兩步法反應中，退火和延伸在同一溫度進行,，可能對某些模板和引物組合效果欠佳,。三步法將退火、延伸分開,，能更好優(yōu)化反應條件,。

解決辦法：嘗試將 PCR 程序改為三步法，即變性,、退火,、延伸分別在不同溫度下進行，依據(jù)引物 Tm 值,，合理設置退火溫度,。

2. 優(yōu)化退火 / 延伸溫度：退火溫度過高，引物和模板結合不充分,；過低,，易產生非特異性擴增。延伸溫度不合適,，會影響 Taq 酶活性和擴增效率,。

解決辦法：以引物 Tm 值為參考，適當降低退火溫度（一般降低 3 - 5℃）,，優(yōu)化延伸溫度（通常 72℃左右）,，通過預實驗確定最佳溫度。

3. 延長退火 / 延伸時間：退火或延伸時間過短,，引物和模板結合不充分,，擴增產物合成，導致 Ct 值過晚,。

解決辦法：在推薦時間基礎上,，適當延長退火 / 延伸時間 10s 左右，觀察擴增效果。

（三）MgCl?濃度不合適Mg²?是 Taq 酶活性必需離子,，濃度過高或過低,，都會影響 Taq 酶活性和擴增效率。濃度過高,，可能增加非特異性擴增,；過低，Taq 酶活性受抑制,。

解決辦法：依據(jù)所用 PCR 試劑盒推薦,，適當調整 MgCl?濃度，通過預實驗確定最適濃度,。

（四）PCR 產物過長  PCR 產物設計超過 500bp,，擴增難度會增加，所需時間更長,，導致 Ct 值過晚。因為長片段擴增對反應條件要求更嚴苛,，容易出現(xiàn)擴增效率低的問題,。

解決辦法：重新設計引物，縮短 PCR 產物長度,，一般控制在 100 - 300bp,，更利于高效擴增。

（五）模板中存在抑制物     模板提取過程中,，若混入蛋白質、多糖,、有機溶劑等雜質,，這些物質可能抑制 Taq 酶活性，降低擴增效率,，使 Ct 值過晚,。解決辦法：使用高純度模板進行 PCR 檢測，或對模板進行稀釋,，降低抑制物濃度,。也可采用模板純化試劑盒，進一步去除雜質,。      更多關于熒光定量 PCR 儀原理,、熒光定量 PCR 儀品牌、熒光定量 PCR 儀價格,、實時熒光定量 PCR 技術,、熒光定量 PCR 實驗步驟等實驗室儀器，實驗耗材，生物試劑相關問題,，歡迎進入蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司網站進行了解,。