百歐博偉生物：菌種在傳代過程中,，因遺傳物質(zhì)發(fā)生變異而引起的原有的優(yōu)良性狀漸漸消失或變壞，出現(xiàn)長勢差,、發(fā)酵效價不高,、質(zhì)量不好、菌落叢生等現(xiàn)象,。這些現(xiàn)象人們泛稱為“退化”,。 菌種退化是一個漸變的過程，發(fā)生有害變異的個體在群體中顯著增多以至占據(jù)優(yōu)勢時才會顯露出來,。因此盡管個體的變異可能是一個瞬時的過程,，但菌種呈現(xiàn)“退化”卻需要較長的時間。菌種退化的本質(zhì)是染色體的變異,，自然界中生物體發(fā)生變異是的,，如果這種變異朝著人們認(rèn)為是壞的方向發(fā)展，就會造成退化,。菌種的整體性能,，在不因外界因素而逐漸變差，且會遺傳給下一代,，就稱為菌株退化,。

需要注意的是，退化和老化是兩個截然不同的概念,。菌種培育過程中隨著菌齡的增加,，養(yǎng)分不斷消耗，菌種必然會出現(xiàn)老化現(xiàn)象,。菌體老化后,，其生命力衰退，色素分泌增加,，細(xì)胞中空泡增多,，甚至破裂,。老化的菌種接入培養(yǎng)基后表現(xiàn)為菌絲生長慢,、抵抗雜菌能力弱、產(chǎn)酶能力下降等,。老化現(xiàn)象不會傳給子代,，這是與退化的區(qū)別。所以,，一旦菌株出現(xiàn)了異?，F(xiàn)象,，首先要分清是老化還是退化，或是單純因為外界培養(yǎng)條件發(fā)生變化而引起,。如果是因老化或外界條件變化引起的異常, 采用新的培養(yǎng)基及適合的培養(yǎng)條件后菌株生長會恢復(fù)原狀,；如果是因退化而引起，則不會改變生長的惡劣狀況,，這時就要對菌株進(jìn)行復(fù)壯,。本文將對菌種退化的原因加以簡析，并給出相應(yīng)有效的預(yù)防措施及復(fù)壯技術(shù),。

一,、退化原因

1、有害突變及細(xì)胞遺傳學(xué)原因

根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)觀點,，細(xì)胞變異和分裂速度密切相關(guān),，分裂速度越快，變異將會越多,。微生物由于分裂速度很快,，分裂中的變異數(shù)量將會增加，而菌種退化與細(xì)胞變異密切相關(guān),。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計,，通常每三百個細(xì)胞中，就會出現(xiàn)一個變異,。在多代傳代繁殖中,，變異概率將會更高。當(dāng)菌種遺傳物質(zhì)發(fā)生變異之后,，突變體往往更能適應(yīng)外界環(huán)境條件,，變異的細(xì)胞再分裂，變異體將會越來越多,，直到最后代謝能力退化,。

2、生理代謝方面的原因

菌種制備時,，菌體培養(yǎng)在特定的培養(yǎng)基上,，這些培養(yǎng)基通常具備菌種生長、發(fā)育及繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì),，如蛋白質(zhì),、糖類、生長因子及水等,。但是,，由于各種營養(yǎng)物質(zhì)的配比不一定，即使一個優(yōu)良的菌株，如果長期使用基本相同的培養(yǎng)基,，其營養(yǎng)不能達(dá)到生理要求,，長此以往培育下去，必然造成營養(yǎng)不良,。除了培養(yǎng)成分配比之外,，培養(yǎng)環(huán)境也是重要方面，如果對其控制不當(dāng),，將會嚴(yán)重影響菌種的生長繁殖,。比如微生物培養(yǎng)時，通常會分泌多種胞外酶,，如纖維素酶,、果膠酶及半纖維素酶等，以分解有機(jī)物進(jìn)而獲得營養(yǎng)及能量,，當(dāng)培養(yǎng)條件不適合時,，這些酶類分泌量會大幅度減少，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)無法利用,，從而生長停止,，如果這種情況長期發(fā)展下去，將會導(dǎo)致菌種退化,。

3,、保藏方式不當(dāng)或長期保藏

目前國內(nèi)外防止菌種退化的辦法是采用液態(tài)氮超低溫保藏。此外,，菌種長期保存或長期使用后,，菌絲長勢減弱，容易提前出現(xiàn)老化現(xiàn)象,。一般的保藏方法,，菌株雖在低溫下保藏，但并未停止其生命活動,，仍然存在著變異的可能,。

4、菌種混雜

在菌種繼代培養(yǎng)過程中,，不同品種間交叉感染,，導(dǎo)致不同品種的菌絲體混雜在一起，造成原有品種生產(chǎn)性狀的改變,，常常表現(xiàn)出產(chǎn)量下降,、質(zhì)量變劣等退化現(xiàn)象。

5,、宿主（感受態(tài)）老化

對于基因工程菌來說,，菌種退化是一個無法回避的問題，也是影響正常發(fā)酵生產(chǎn)的障礙,。其具體表現(xiàn)形式一般為發(fā)酵早期溶菌,、菌體生長緩慢、糖代謝異常,、發(fā)酵OD低以及酶活（效價）差等,，嚴(yán)重影響了發(fā)酵批次的穩(wěn)定性。對于工程大腸桿菌來說,，其異常表現(xiàn)與污染噬菌體有類似之處,，判斷起來有一定的迷惑性。而究其原因,，大多數(shù)情況是由于宿主感受態(tài)自身發(fā)生老化或退化引起,。這種情況下，即使更換發(fā)酵設(shè)備或者對發(fā)酵環(huán)境全面凈化處理也無濟(jì)于事,。

二,、菌種退化的預(yù)防及其復(fù)壯措施

1、定期分離菌種,以達(dá)到純化效果

在菌種培養(yǎng)中,，為了保證菌種質(zhì)量,，每隔1至2年，必須對原菌種進(jìn)行分離,。菌種純化是常用的一種復(fù)壯方法,。原理是定期分離菌種，將退化的菌種分離剔除,，挑選出具有優(yōu)良性狀的菌株在適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng),，恢復(fù)菌種原有的生長狀態(tài)，再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),。

2,、控制菌種傳代次數(shù)

由于菌種退化和傳代次數(shù)密切相關(guān)，應(yīng)在培養(yǎng)中給予重視,，一般情況下,，代數(shù)不能超過5代。菌種在多次傳代過程中會發(fā)生少量基因的突變,，到突變達(dá)到一定程度時,，就會造成遺傳物質(zhì)的改變，然而頻繁傳代一般都是負(fù)變異占優(yōu)勢,。因此,，控制菌種的傳代次數(shù)也是防止菌種退化和維持原有性狀的有效措施之一。

3,、采用適宜的保藏方法

建議采用液氮超低溫保藏,，液氮超低溫保藏法是將需要保藏的菌種和保護(hù)劑按一定的比例放于凍存管中，再將凍存管保藏在超低溫液氮中。常用的保護(hù)劑有甘油,、血清蛋白,、二甲基亞礬、聚乙烯氮戊環(huán),、糊精,、吐溫80等，不同的菌種要根據(jù)自己的特性選擇不同的保護(hù)劑,。在超低溫環(huán)境中菌種幾乎喪失了代謝功能,，保持了菌株原有的性狀，變異的可能性也大大降低,，這種方法對大部分菌株都適用,，且保存時間長達(dá)數(shù)年。具體操作方法：把已做好的安瓿菌種管放入具有孔洞的小塑料瓶中（ 在塑料瓶的底部放一塊重物,，使塑料瓶連同安瓿管能一起沉入液氮罐中）,，蓋好瓶蓋，在瓶蓋上連接一條細(xì)繩并作記號,，以便提出所需的菌種,。把裝有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管緩慢地降溫,，大約30分鐘后,，把安瓿管浸入液氮中進(jìn)行長期保存。啟用液氮罐中保存的菌種時,， 應(yīng)先將安瓿管置于35~40℃的溫水中,，使瓶內(nèi)的冰塊迅速融解，然后在無菌條件下開啟安瓿管,，用接種針取菌塊移接于適宜的培養(yǎng)基上活化培養(yǎng),。

4、菌絲分離

挑取健壯菌絲體頂端部分進(jìn)行純化培養(yǎng),，以保持菌種的純度,，使菌種恢復(fù)原來的生活力和優(yōu)良種性，達(dá)到復(fù)壯的目的,。

5,、適當(dāng)更換培養(yǎng)基

長期在同一培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的菌種，活力可能逐漸下降,。在菌種保藏傳代中,，經(jīng)常改變培養(yǎng)基成分，或在原有的培養(yǎng)基中添加酵母膏,、麥芽汁,、氨基酸類物質(zhì)和維生素等,，以刺激菌絲生長，提高菌種活力,。

6,、更新原始宿主菌

工程菌出現(xiàn)菌種退化問題后，技術(shù)人員常用的對策是重新轉(zhuǎn)化保種,，誤以為這樣可以解決問題，這種做法對有些退化情況或者短期內(nèi)可能有一定效果,，但其實并不能解決問題,，類似發(fā)酵異常問題往往還是周而復(fù)始反復(fù)出現(xiàn)。需要明白的是,，宿主本身也是菌種,，也存在老化退化問題，只有更換原始出發(fā)宿主菌,，并更新其相應(yīng)感受態(tài),，然后再轉(zhuǎn)化保種，才有可能頑疾,。

三,、酵母菌純化復(fù)壯流程舉例

1、菌種活化：將酵母菌種接種在5 % YPD 固體斜面上,，30 ℃恒溫培養(yǎng)1 d,，重復(fù)2 次。用滅菌牙簽挑取適量活化的酵母菌斑接種于5 mL 液體YPD 培養(yǎng)基中,，于30℃,、200 r/min 搖床震蕩培養(yǎng)12～16 h，此時可達(dá)到對數(shù)生長期,。

2,、初篩：取上述活化菌液100 μL，置于5 mL PDA 培養(yǎng)基3 種不同的液體培養(yǎng)基中,，于30℃,、200 r/min 搖床震蕩培養(yǎng)12～16 h，分別稀釋為10 萬倍和100 萬倍2 個濃度梯度,，取50 μL 稀釋液涂布到相應(yīng)的固體PDA 培養(yǎng)基平皿中,，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察并記錄菌落生長情況,。

3,、復(fù)篩：挑出光滑圓潤、色澤乳白,、形狀規(guī)則且較大的菌斑,，用牙簽挑取少許置于5 mL PDA液體培養(yǎng)基中,，30 ℃ 200 r/min 搖培過夜。取1.5 mL 菌液3500 r/min 離心5 min 得菌體,，加入1 mL PDA液體培養(yǎng)基重懸,，山梨醇、甘油處理過夜,。取1 mL 處理后的菌液離心得菌體,，分別加入1 mLPDA液體培養(yǎng)基重懸，稀釋10 萬倍后涂布在固體PDA培養(yǎng)基上,，30 ℃恒溫培養(yǎng),，3 d后觀察記錄。

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