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食安無憂 | 熒光測(cè)定法研究酶動(dòng)力學(xué)

來源：珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司 2025年07月07日 13:52

酶促反應(yīng)是指由一類被稱為酶的特殊物質(zhì)所催化的化學(xué)反應(yīng),。這些物質(zhì)通常是蛋白質(zhì),，通過與分子(稱為底物)的特殊結(jié)合發(fā)揮作用，并在不被消耗或永久改變的情況下將其轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物,。這種結(jié)合降低了反應(yīng)進(jìn)行所需的活化能,，從而加快了化學(xué)反應(yīng)速度。酶作為高度特異性和高效的生物催化劑,，廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)過程,，包括臨床診斷、藥物開發(fā),、食品和飲料,、紡織工業(yè)、生物燃料生產(chǎn)等,。了解酶動(dòng)力學(xué)及其關(guān)鍵參數(shù)對(duì)于優(yōu)化此類生物技術(shù)過程的效率和成本效益至關(guān)重要,。在下一節(jié)中，我們將討論米氏模型,，它作為生物化學(xué)中理解和量化酶動(dòng)力學(xué)的基本工具,，為了解酶的特性和功能提供關(guān)鍵的見解。

米氏模型

一個(gè)簡單的酶促反應(yīng)可以描述如下:

其中E是酶,，S是底物,，ES是酶-底物復(fù)合物，P是生成產(chǎn)物,。

當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)高于酶濃度([S]>>[E])時(shí),，在穩(wěn)態(tài)假設(shè)下(ES的生成速率等于其分解速率)

酶促反應(yīng)可以用米氏方程來描述，該方程將反應(yīng)速度v與底物濃度[S]聯(lián)系起來,，表達(dá)式為(等式1)：^1,2

其中：

v是反應(yīng)速度;

V_max為最大反應(yīng)速度,，即底物使所有酶活性位點(diǎn)飽和時(shí)的反應(yīng)速度;

[S]是底物濃度;

K_m為米氏常數(shù)，表示反應(yīng)速度為V_max值一半時(shí)的底物濃度,。

當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí),，反應(yīng)速度與底物濃度成正比,。隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速度最終達(dá)到最大值(V_max),，此時(shí)底物飽和,。常數(shù)K_m是衡量酶對(duì)底物親和力的指標(biāo)。K_m值越低表明親和力越高,，這意味著酶在較低底物濃度下可以達(dá)到其最大速度的一半,。米氏方程對(duì)于理解酶動(dòng)力學(xué)至關(guān)重要，常用于通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定酶參數(shù),。最常用的方法是比色測(cè)定法,，它依賴于紫外/可見分光光度計(jì)來測(cè)量產(chǎn)物的形成，這種產(chǎn)物對(duì)光的吸收通常與底物不同³,。熒光測(cè)定法也可用于提高動(dòng)態(tài)范圍和分析靈敏度^4,5,。

本文利用熒光底物3-(4-羥基苯基)丙酸(HPPA)研究辣根過氧化物酶HRP的活性^6,7。辣根過氧化物酶(HRP)是免疫測(cè)定中最常用的標(biāo)記酶之一,，它在有過氧化氫(H₂O₂)存在的條件下催化多種供氫底物^8,9。通過制備不同的底物濃度,，并利用FL 6500熒光光譜儀監(jiān)測(cè)熒光產(chǎn)物強(qiáng)度隨時(shí)間的變化(λ_exc=290 nm和λ_m=410 nm),，構(gòu)建米氏圖。由于溫度是影響酶活性的重要因素之一,，本文使用連接到珀金埃爾默F(xiàn)L 6500^?熒光光譜儀的Peltier系統(tǒng)來設(shè)置溫度,，同時(shí)收集熒光酶動(dòng)力學(xué),，以研究溫度效應(yīng)。

試劑和方法

磷酸氫二鉀,、磷酸二氫鈉二水合物、3-(4-羥基苯基)丙酸(HPPA),、辣根過氧化物酶(HRP),、30%過氧化氫(H₂O₂)溶液,、氫氧化鈉(NaOH)和乙醇(EtOH)均購自默克公司,。

試劑制備方法如下：

磷酸鹽緩沖液0.1 M pH 8.0 250 mL：將4.07 g磷酸氫二鉀和252 mg磷酸二氫鈉二水合物溶解于250 mL水中。

底物HPPA 2.5 g/L(15 mM)溶于5 mL磷酸鹽緩沖液中:首先將0.1 g HPPA溶解于2 mL EtOH(50 g/L)中,。取0.25 mL體積,，加入4.75 mL磷酸緩沖液中,，配制成最終體積為5 mL的HPPA 2.5 g/L磷酸鹽緩沖溶液。

酶HRP 80 μg/L(2 nM)溶于5 mL磷酸鹽緩沖液中：取0.005 g HRP溶解于25 mL磷酸鹽緩沖液中,，制得0.2 g/L溶液。從HRP 0.2 g/L溶液中取0.1 mL體積,，加入4.9 mL磷酸鹽緩沖液,，得到0.004 g/L濃度。從HRP 0.004 g/L中取0.1 mL進(jìn)一步稀釋,，加入4.9 mL磷酸鹽緩沖液中,，配制成最終體積為5 mL的HRP 80 μg/L磷酸鹽緩沖溶液。

H₂O₂0.24% v/v磷酸緩沖液：從30% v/v H₂O₂儲(chǔ)備液中取0.04 mL,，加入4.96 mL磷酸緩沖液中,，配制成0.24% H₂O₂最終溶液。

將HPPA儲(chǔ)備液(2.5 g/L)稀釋在磷酸鹽緩沖液中,，制備不同的底物溶液(覆蓋范圍為0.05~0.5 g/L,，最終體積為1780 μL)，以實(shí)現(xiàn)熒光酶測(cè)定法,。對(duì)于每種熒光測(cè)定動(dòng)力學(xué),，底物溶液都是直接在標(biāo)準(zhǔn)的10毫米熒光比色皿中配制的，并等待5分鐘以穩(wěn)定溶液溫度,，然后再繼續(xù)添加(溫度由浸入溶液中的外部探針確認(rèn)),。然后通過添加50 μL HRP酶(80 μg/L)和170 μL H₂O₂(0.24%)來啟動(dòng)酶促反應(yīng)，最終體積為2 mL,。在最后一次添加H₂O₂后,，采用Spectrum FL軟件中的動(dòng)力學(xué)方法開始熒光動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采集，參數(shù)如表1所示,。

表1.用于采集HPPA酶動(dòng)力學(xué)的FL 6500熒光參數(shù)

如圖1所示,，將Peltier控制器連接到FL 6500熒光光譜儀以研究溫度對(duì)HRP酶參數(shù)的影響。溫度可以在Peltier控制器上手動(dòng)設(shè)置,。

圖1.FL 6500熒光分光光度計(jì)連接到Peltier控制器以采集酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)

結(jié)果

圖2顯示了在磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中存在H₂O₂的條件下,，在15°C時(shí)使用熒光底物HPPA研究HRP酶活性所獲得的結(jié)果。每次熒光動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采集時(shí)間為30分鐘,。該圖顯示了在所有底物濃度的動(dòng)力學(xué)采集結(jié)束時(shí)在Spectrum FL軟件中所示的數(shù)據(jù),。左圖為相應(yīng)濃度(0.05 g/L-0.5 g/L)的樣品列表，以及軟件根據(jù)計(jì)算時(shí)間得到的初始速度,。通過改變起始值和結(jié)束值,，可以輕松修改計(jì)算時(shí)間。

在本研究中,，由于觀察到線性關(guān)系在前5分鐘內(nèi)有效,，因此計(jì)算時(shí)間設(shè)定為0至5分鐘,。圖2中間部分為所選熒光動(dòng)力學(xué)情況([S]=0.3 g/L)，右側(cè)部分為反應(yīng)速度隨HPPA濃度變化的米氏圖,。在米氏圖下方,，報(bào)告了酶參數(shù)V_max=1148 au/min和K_m=0.08 g/L。如米氏圖(圖2右)所示,，在低底物濃度下,，反應(yīng)速度隨底物濃度線性增加。這是因?yàn)樵诘蚚HPPA]時(shí),，可供結(jié)合的HRP活性位點(diǎn)數(shù)量很高,，并且每個(gè)底物分子都有很高的概率找到酶。隨著HPPA濃度的增加,，反應(yīng)速度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),。此時(shí)，底物分子使所有HRP活性位點(diǎn)飽和,，幾乎所有可用的酶分子均與底物結(jié)合,。底物濃度的進(jìn)一步增加對(duì)反應(yīng)速度幾乎沒有影響，因?yàn)樗蠬RP分子都已經(jīng)以最大通量參與催化反應(yīng),。反應(yīng)速度主要受空余酶分子的可用性的限制,。

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圖2.15℃時(shí)磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中存在H₂O₂的條件下HRP對(duì)HPPA的酶活性。在熒光動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采集結(jié)束時(shí),，結(jié)果顯示在Spectrum FL軟件中,。包含計(jì)算時(shí)間和繪圖模型的樣品表(左)；[HPPA]=0.3 g/L的選定熒光動(dòng)力學(xué)情況(中)以及包含所得V_max和K_m的米氏圖(右)

為了更直觀地了解酶參數(shù),，通常使用Lineweaver-Burk圖(圖3,，右圖)。

? 點(diǎn)擊查看大圖

圖3.15℃時(shí)磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中存在H₂O₂的條件下HRP對(duì)HPPA的酶活性,。在熒光動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采集結(jié)束時(shí),，結(jié)果顯示在Spectrum FL軟件中。包含計(jì)算時(shí)間和繪圖模型的樣品表(左),；[HPPA]=0.3 g/L的選定熒光動(dòng)力學(xué)情況(中)以及包含所得V_max和K_m的Lineweaver-Burk圖(右)

它是從米氏方程推導(dǎo)出的雙倒數(shù)圖,，其中反應(yīng)速度的倒數(shù)與底物濃度的倒數(shù)繪制如下：

它是米氏方程的線性形式，其中Y軸的截距對(duì)應(yīng)于：

X軸的截距對(duì)應(yīng)于：

在Spectrum FL軟件中,，可以在可用模型的下拉列表中輕松選擇模型：Michaelis-Menten,、Lineweaver-Burk、Hofstee,、Eadie-Hofstee(圖3左上),。

溫度效應(yīng)

使用連接到FL 6500熒光光譜儀的Peltier控制器研究溫度對(duì)HRP酶活性的影響。Peltier控制器允許在采集熒光動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的同時(shí)為Peltier比色皿支架設(shè)置特定溫度。圖4顯示了在15°C,、37°C和45°C下得到的米氏圖的比較,。表2為所得的V_max和K_m。當(dāng)溫度從15°C升高到37°C時(shí),，V_max從1148 au/min增加到1337 au/min,，K_m從0.08 g/L增加到0.09 g/L，但酶參數(shù)并未受到溫度從37°C升高到45°C的影響,。這可以解釋為，隨著溫度的升高,，HRP接近變性溫度50-60°C,，由此產(chǎn)生的構(gòu)象變化可以修飾活性位點(diǎn)，進(jìn)而改變其酶活性,。

表2. 溫度對(duì)酶參數(shù)V_max和K_m的影響

圖4.存在H₂O₂時(shí),，在15℃(粉色)、37℃(藍(lán)色)和45℃(黃色)獲得HRP對(duì)HPPA的酶活性的米氏圖

結(jié)論

酶促反應(yīng)是許多生物和生物技術(shù)過程的基礎(chǔ),，包括藥物發(fā)現(xiàn),、臨床診斷、食品生產(chǎn)和生物燃料合成,。研究酶催化反應(yīng)為理解酶活性的機(jī)制提供了有價(jià)值的見解,，有助于實(shí)現(xiàn)具有更高可持續(xù)性、效率和成本效益的過程,。本研究在存在H₂O₂的條件下利用熒光底物HPPA研究了HRP的酶活性,。使用FL 6500熒光光譜儀采集一系列底物濃度的熒光動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。米氏圖由Spectrum FL軟件自動(dòng)構(gòu)建,，該軟件還可快捷地提供酶常數(shù)V_max和K_m,。將熒光計(jì)連接到Peltier控制器進(jìn)行動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采集，以研究溫度對(duì)酶活性的影響,。溫度從15°C升高到37°C會(huì)導(dǎo)致V_max增加和K_m略微增加,，但溫度從37°C升高到45°C時(shí)酶參數(shù)并未受到的影響。

這項(xiàng)研究表明,，連接到Peltier系統(tǒng)的FL 6500熒光光譜儀對(duì)于想要了解酶促反應(yīng)的研究者來說是一個(gè)強(qiáng)大的工具,。此外，借助Spectrum FL軟件,，可以輕松獲得米氏圖和酶常數(shù),，為此類分析提供快速簡便的解決方案。

部件號(hào)

參考文獻(xiàn)

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