胃腸道運動障礙是一類常見的疾病，包括食管失弛緩癥,、胃輕癱,、腸假性梗阻和慢性便秘等,。這些疾病通常與腸道神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）中抑制性NO產(chǎn)生運動神經(jīng)元的功能障礙有關(guān)。由于缺乏有效的治療方法,，這些疾病對患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響,。

利用hPSCs開發(fā)一個能夠模擬人類ENS的體外模型，包括二維（2D）ENS培養(yǎng)和三維（3D）神經(jīng)節(jié)類器官,。這些模型不僅能夠模擬ENS的發(fā)育過程,，還能用于藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用。通過單細(xì)胞RNA測序技術(shù),，詳細(xì)分析NO神經(jīng)元的分子特征,，并通過高通量小分子篩選，發(fā)現(xiàn)了能夠調(diào)節(jié)NO神經(jīng)元活性的藥物,。

Kirkstall Quasi Vivo®類器官串聯(lián)芯片3D動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)

（一）構(gòu)建能夠模擬人類腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能的3D腸神經(jīng)節(jié)類器官模型,。這些模型不僅能夠用于研究腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育機制，還可以用于藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)研究,。

1. hPSCs的培養(yǎng)和維持

- 使用hESC（人類胚胎干細(xì)胞）系H9（WA09-WiCell）或iPSC（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）系WTC-11,。

- hPSCs在Geltrex包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，使用E8培養(yǎng)基進行維持,。

- 每30天檢測一次支原體污染,。

2. ENCC（腸神經(jīng)嵴細(xì)胞）的誘導(dǎo)

- 當(dāng)hPSCs單層培養(yǎng)達到約70%匯合時，開始12天的ENCC誘導(dǎo)方案,。

- 第0天：吸去E8培養(yǎng)基,，替換為神經(jīng)嵴誘導(dǎo)培養(yǎng)基A（含有BMP4、SB431542和CHIR 99021的Essential 6培養(yǎng)基）,。

- 第2天和第4天：使用神經(jīng)嵴誘導(dǎo)培養(yǎng)基B（含有SB431542和CHIR 99021的Essential 6培養(yǎng)基）,。

- 第6天、第8天和第10天：使用培養(yǎng)基C（培養(yǎng)基B中加入視黃酸）,。

- 第12天：吸去培養(yǎng)基C，用Accutase處理ENCC單層細(xì)胞（30分鐘,，37°C,，5% CO?），離心后將ENCC重懸于NC-C培養(yǎng)基（含有FGF2,、CHIR 99021,、N2補充劑、B27補充劑,、Glutagro和MEM NEAAs的Neurobasal培養(yǎng)基）中,，轉(zhuǎn)移到超低吸附板中形成自由懸浮的3D腸神經(jīng)嵴球體（enteric crestospheres）。

3. 腸神經(jīng)元的誘導(dǎo)

- 第15天：將腸神經(jīng)嵴球體聚集到孔中心,，移除NC-C培養(yǎng)基,，根據(jù)最終培養(yǎng)布局（2D ENS培養(yǎng)或3D腸神經(jīng)節(jié)類器官）進行不同處理,。

- 對于3D腸神經(jīng)節(jié)類器官：

- 避免使用Accutase處理，直接向腸神經(jīng)嵴球體中加入相同體積的腸神經(jīng)元培養(yǎng)基（含有GDNF,、抗壞血酸,、N2補充劑、B27補充劑,、Glutagro和MEM NEAAs的Neurobasal培養(yǎng)基）,。

- 每隔一天更換一次腸神經(jīng)元培養(yǎng)基，直到第30-40天,，之后可以減少更換頻率,，但需增加更換培養(yǎng)基的量。

4. 3D腸神經(jīng)節(jié)類器官的培養(yǎng)和維護

- 在第15天之后,，腸神經(jīng)嵴球體在腸神經(jīng)元培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),，逐漸分化為腸神經(jīng)節(jié)類器官。

- 培養(yǎng)過程中,，每隔一天更換一次培養(yǎng)基,，直到第30-40天。

- 從第40天開始,，可以減少更換培養(yǎng)基的頻率,，但需增加每次更換的培養(yǎng)基量，以維持類器官的長期培養(yǎng),。

5. 功能驗證和分析

- 免疫熒光染色：用于檢測神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的表達,，驗證類器官中不同細(xì)胞類型的形成。

- 單細(xì)胞RNA測序：用于分析類器官中細(xì)胞類型的分子特征,，鑒定NO神經(jīng)元等特定亞型,。

- 鈣成像和電生理記錄：用于評估神經(jīng)元的活性和功能成熟度。

- 藥物篩選和功能測試：通過高通量篩選,，鑒定能夠調(diào)節(jié)NO神經(jīng)元活性的化合物,，并在體外和體內(nèi)模型中驗證其功能。

（二）在進行類器官傳代時,，需要注意以下幾個關(guān)鍵事項

1. 傳代前的準(zhǔn)備

- 培養(yǎng)基準(zhǔn)備：確保使用適合類器官生長的培養(yǎng)基,，如含有特定生長因子和信號分子的培養(yǎng)基。對于腸類器官,，可以使用成熟商業(yè)化類器官生長培養(yǎng)基,。

- 基質(zhì)準(zhǔn)備：使用適合的細(xì)胞外基質(zhì)材料，如Matrigel,，以支持類器官的三維結(jié)構(gòu),。

- 工具和材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備好所有需要的工具和材料，如溫和細(xì)胞解離試劑,、離心管,、移液槍頭等,，并確保它們處于適當(dāng)溫度（如4°C或室溫）。

2. 類器官的處理

- 觀察和評估：在顯微鏡下觀察類器官,，確保其健康狀態(tài)良好,。

- 溫和解離：使用溫和的細(xì)胞解離試劑（如TrypLE或Gentle Cell Dissociation Reagent）來解離類器官，避免對細(xì)胞造成損傷,。

- 避免過度解離：解離時間不宜過長,，以免損傷細(xì)胞。對于小鼠腸類器官,，室溫下孵育1分鐘即可,。

3. 離心和重懸

- 離心條件：以適當(dāng)?shù)碾x心力（如290×g，4°C,，5分鐘）離心,，以收集類器官。

- 重懸：使用預(yù)冷的培養(yǎng)基或基質(zhì)重懸類器官,，避免產(chǎn)生氣泡,。

4. 接種和培養(yǎng)

- 基質(zhì)和類器官混合：將類器官與Matrigel等基質(zhì)混合后，快速接種到培養(yǎng)板中,，形成凝固的dome,。

- 培養(yǎng)條件：確保培養(yǎng)板在37°C、5% CO?的條件下培養(yǎng),，以促進Matrigel的凝固和類器官的生長,。

- 避免直接接觸：加入培養(yǎng)基時，應(yīng)避免直接沖擊dome,，以免破壞其結(jié)構(gòu),。

5. 培養(yǎng)后的維護

- 定期換液：每周進行三次換液，以維持類器官的生長,。

- 監(jiān)控生長：定期觀察類器官的生長情況,，確保其健康和正常發(fā)育。

- 傳代比例：根據(jù)類器官的生長速度,，選擇合適的傳代比例（如1:2至1:6）,。

6. 其他注意事項

- 傳代頻率：根據(jù)類器官的生長情況，定期進行傳代,，通常每7至10天進行一次。

- 冷凍保存：在長期培養(yǎng)過程中,，可以將類器官進行冷凍保存,，以便后續(xù)使用。

- 基因穩(wěn)定性：長時間傳代可能導(dǎo)致類器官的基因穩(wěn)定性發(fā)生變化,，因此需要定期進行基因檢測,。

（三）展望：結(jié)合Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片動態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建系統(tǒng),，確保3D腸-腦類器官的長期培養(yǎng)

1. 優(yōu)化培養(yǎng)基和灌流條件

- 培養(yǎng)基成分：使用適合腸神經(jīng)節(jié)類器官的培養(yǎng)基，如含有GDNF,、抗壞血酸,、N2補充劑、B27補充劑,、Glutagro和MEM NEAAs的Neurobasal培養(yǎng)基,。此外，可以參考其他研究中使用的培養(yǎng)基成分,，如添加RSPO1,、EGF、PGE2等,，這些成分對于維持腸干細(xì)胞的增殖和功能至關(guān)重要,。

- 灌流參數(shù)：通過Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng) 精確控制灌流參數(shù)，如流速,、流量等,，確保類器官之間的物質(zhì)交換和信號傳遞接近體內(nèi)真實生理狀態(tài)。

2. 模擬體內(nèi)微環(huán)境

- 細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）：使用適合的基質(zhì)材料,，如Matrigel,，來模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。Matrigel是一種常用的基質(zhì),，能夠提供必要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,，支持類器官的三維結(jié)構(gòu)和功能。

- 動態(tài)灌流：利用Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng)的動態(tài)灌流功能,，模擬體內(nèi)血液循環(huán)和組織間液流動,，為類器官提供持續(xù)的營養(yǎng)供應(yīng)和廢物清除。

3. 定期傳代和監(jiān)測

- 傳代頻率：根據(jù)類器官的生長情況,，定期進行傳代,，通常每7天進行一次。傳代時,，可以使用溫和的細(xì)胞解離試劑,，如TrypLE，將類器官分解成較小的片段或單細(xì)胞,，然后重新嵌入到新鮮的基質(zhì)中,。

- 監(jiān)測和評估：定期監(jiān)測類器官的形態(tài)、細(xì)胞活性和功能,?？梢允褂免}黃綠素和碘化丙啶雙染等方法檢測細(xì)胞活性。此外,，通過免疫熒光染色和單細(xì)胞RNA測序等技術(shù),，評估類器官中不同細(xì)胞類型的形成和功能,。

4. 利用微流控技術(shù)促進細(xì)胞間相互作用

- 細(xì)胞間信號傳遞：通過Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng)的微流控通道，連接不同的類器官模塊,，模擬體內(nèi)細(xì)胞間的信號傳遞,。例如，可以將腸神經(jīng)節(jié)類器官與腸道類器官連接,，研究神經(jīng)信號對腸道功能的調(diào)控,。

- 模擬生理剪切應(yīng)力：利用微流控設(shè)備產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，模擬體內(nèi)腸道的機械運動,，促進類器官的功能成熟,。

5. 長期培養(yǎng)的優(yōu)化

- 冷凍保存：在長期培養(yǎng)過程中，可以將類器官進行冷凍保存,，以便后續(xù)使用,。這有助于保持類器官的基因穩(wěn)定性和功能特性。

- 基因編輯和標(biāo)記：利用基因編輯技術(shù)（如CRISPR-Cas9）對類器官進行標(biāo)記或功能改造,，以便更好地研究其在長期培養(yǎng)中的變化,。

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