近年來隨著光譜流式細(xì)胞儀的發(fā)展,，大大擴(kuò)展了流式細(xì)胞術(shù)的分析維度,，使得流式實(shí)驗(yàn)可同時(shí)檢測(cè)20+參數(shù),，為免疫學(xué),、腫瘤學(xué)、藥物研發(fā)等生命科學(xué)領(lǐng)域的研究工作提供一個(gè)高效,、得力的工具,。

本文主要介紹了一個(gè)專門用于研究自然殺傷(NK)細(xì)胞的25色光譜流式實(shí)驗(yàn)方案。NK細(xì)胞是一類負(fù)責(zé)通過識(shí)別特定標(biāo)志物或其缺失來識(shí)別并清除受感染或癌變細(xì)胞的免疫細(xì)胞亞群（圖1）,。本研究旨在探究與NK細(xì)胞活化、抑制及成熟相關(guān)的多種標(biāo)志物,。該光譜實(shí)驗(yàn)方案共包含 25 種標(biāo)志物,，并專為 Attune Xenith 全光譜流式細(xì)胞儀優(yōu)化設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量細(xì)胞的高速分析,。下文中我們總結(jié)了該多色方案的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),、所選標(biāo)志物及其在NK細(xì)胞研究中的重要性。

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圖1. NK細(xì)胞通過識(shí)別特定細(xì)胞標(biāo)志物的存在與否作出相應(yīng)反應(yīng)

Attune Xenith 25色光譜流式實(shí)驗(yàn)方案

Attune Xenith 25色光譜流式實(shí)驗(yàn)步驟

一、 試劑準(zhǔn)備

1. LIVE/DEAD 工作液：

a. 按照說明書制備 LIVE/DEAD Fixable Near IR  876 染料,。

b. 取 1 µL LIVE/DEAD Fixable Near IR  876 溶液加到 49 µL 1× PBS 中制備工作液,，輕輕上下吹打混勻。

2. 按照說明書制備細(xì)胞因子分裝液,，儲(chǔ)存于 -80 ℃ 備用,。

a. 加入所選培養(yǎng)基的終濃度將為100 U/mL IL-2、10 ng/mL IL-15 和 25 ng/mL IL-21,。

3. 將 AIM-V 培養(yǎng)基放在 37 ℃ 水浴鍋中預(yù)熱,。

4. 如需進(jìn)行細(xì)胞刺激：

a. 制備含 5% 熱滅活 FBS 和 100 U/mL 青霉素-鏈霉素雙抗的 NK-Xpander 培養(yǎng)基。

b. 放在 37 ℃ 水浴鍋中預(yù)熱,。

二,、PBMC復(fù)蘇

1. 將密封良好的凍存 PBMC 凍存管置于 37 ℃ 水浴中約 90 秒，隨后每隔 15-20 秒輕輕顛倒混勻 3-4 次,，直至瓶內(nèi)約 75% 內(nèi)容物呈液態(tài),。

2. 從水浴鍋中取出 PBMC 凍存管,，擦凈管外壁殘留的水分。

3. 對(duì)于每管凍存的PBMC（體積約 1 mL,，含約 5×10? 個(gè)細(xì)胞）：

a. 將 PBMC 輕輕倒入 50 mL 離心管中,，加入 10 mL 預(yù)熱的 AIM-V 培養(yǎng)基。

b. 再向每個(gè) PBMC 瓶中緩慢加入 2 mL AIM-V 培養(yǎng)基,，倒入第 3a 步中使用的同一支 50 mL 離心管中,，并重復(fù)一次。

c. 400×g 離心 5 分鐘,，輕輕棄去上清液,。

d. 用1× PBS重懸 PBMC，并輕輕上下吹打混勻（根據(jù)所需細(xì)胞濃度,，使用 1 ~10 mL 任意體積的 PBS 重懸細(xì)胞）,。

e. 輕輕顛倒混勻細(xì)胞懸液數(shù)次，使用 Countess 3 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀記錄細(xì)胞濃度及存活率,。

注：若細(xì)胞存活率低于90%,，建議另取一管新的 PBMC，重新制備細(xì)胞樣本,。

三,、細(xì)胞刺激

1. 分裝細(xì)胞刺激用的細(xì)胞懸液。

a. 將適量體積的細(xì)胞懸液分裝至各離心管中,，建議細(xì)胞刺激時(shí)使用至少 9×10? 個(gè)活細(xì)胞,。

b. 400×g 離心 5 分鐘，輕輕棄去上清液,。

c. 將各刺激管中的細(xì)胞重懸于 NK-Xpander 培養(yǎng)基中,，調(diào)整濃度至 3×10? 個(gè)活細(xì)胞/mL。

d. 將陰性對(duì)照（未刺激）管中的細(xì)胞重懸于 1× PBS 中,，調(diào)整濃度至 1×10? 個(gè)活細(xì)胞/mL,，直接進(jìn)行細(xì)胞染色步驟。

2. 向待刺激細(xì)胞懸液中加入 IL-2 至終濃度 100 U/mL,、IL-15 至 10 ng/mL 以及 IL-21 至 25 ng/mL,。

3. 分裝至 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔的最小體積為 1 mL,。

4. 37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 48 小時(shí)

a. 48 小時(shí)后,，將細(xì)胞懸液從培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至離心管中，吹打數(shù)次混勻,。

b. 輕輕顛倒混勻細(xì)胞懸液管數(shù)次,，使用 Countess 3 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀記錄濃度及存活率。

四,、細(xì)胞染色

1. 用1× PBS重懸PBMC,，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×10? 個(gè)活細(xì)胞/mL,。

2. 輕輕顛倒混勻細(xì)胞懸液管數(shù)次，用70 μm 細(xì)胞濾器過濾至新的 50 mL 離心管中,。

3. 制備熱激處理的細(xì)胞作為細(xì)胞活性染料單染對(duì)照：

a. 將 1 mL細(xì)胞懸液（1×10? 個(gè)細(xì)胞）加入微量離心管中,，置于加熱塊上，于 65 ℃ 孵育 5 分鐘,。從加熱塊上取下,，冰上放置 2–3 分鐘。

b. 向熱塊孵育后的冷卻微量離心管中加入 500 μL 新鮮制備的PBMC懸液,。

4. 分出足量的 PBMC 用于未染色和單染管對(duì)照（不加入細(xì)胞活性染料）,。

5. 向剩余的PBMC懸液中每 1 mL PBMC 加入 1 μL L/D死活染料工作液，輕輕吹打數(shù)次混勻,。

6. 將所有細(xì)胞懸液 4 ℃ 避光孵育 30 分鐘,。

7. 4 ℃  400×g 離心 5 分鐘，棄上清,，并用吸水紙短暫接觸吸除殘留液體,。

8. 用eBioscience 流式染色緩沖液重新細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×10? 個(gè)/mL,，輕輕吹打混勻,。

9. 每 10? 個(gè)細(xì)胞（即 100 μL 重懸液）懸液中，加入 20 μL 人 BD Fc Block™,、10 μL Brilliant stain buffer和 5 μL CellBlox Plus blocking buffer進(jìn)行封閉處理,輕輕渦旋混勻。

10.  4 ℃避光孵育 15 分鐘,。

11. 將 100 μL 封閉后的細(xì)胞懸液分別轉(zhuǎn)移至各流式管中備用,。

a. 樣本為經(jīng) LIVE/DEAD Fixable Near IR  876 染料染色的批量 PBMC 細(xì)胞。

b. 細(xì)胞活性單染對(duì)照使用熱激處理過的染色細(xì)胞懸液,。

c. 未染色及所有其他單染細(xì)胞對(duì)照使用未染色的細(xì)胞懸液,。

12. 向樣品管和對(duì)照管中加入相應(yīng)的適量抗體，輕輕渦旋混勻,。

13. 4 ℃ 避光孵育 30 分鐘,。

14. 加入 1 mL eBioscience 流式染色緩沖液洗滌樣本。

15. 4 ℃ 400×g 離心 5 分鐘,，棄上清,，并用吸水紙短暫接觸以吸除殘留液體。

16. 將細(xì)胞沉淀重懸于 1 mL eBioscience 流式染色緩沖液中,，輕輕吹打混勻,。

17.  4 ℃ 400×g 離心 5 分鐘，棄上清,，用吸水紙短暫接觸以吸除殘留液體,。

18. 將細(xì)胞沉淀重懸于 200 μL eBioscience 流式染色緩沖液中,，輕輕吹打混勻。

19. 立即上機(jī)分析或使用 eBioscience 細(xì)胞固定液進(jìn)行細(xì)胞固定,。

注：LIVE/DEAD 可固定細(xì)胞活性染料可用于新鮮樣本,，并且在多種固定劑中都能保持穩(wěn)定。若使用其他細(xì)胞活性染料,，需在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行測(cè)試,，確保固定前后死細(xì)胞的染色效果一致。

五,、實(shí)驗(yàn)對(duì)照

1. 按照說明書制備 UltraComp eBeads Plus 補(bǔ)償微球,。

2. 使用 eBioscience 細(xì)胞固定液進(jìn)行微球固定或立即上機(jī)分析。

注：微球?qū)φ盏奶幚矸绞綉?yīng)與染色的細(xì)胞對(duì)照一致,。如果對(duì)照管和樣本管細(xì)胞進(jìn)行了固定和/或破膜處理,，則需對(duì)微球?qū)φ者M(jìn)行相同的處理流程。

Attune Xenith 25色光譜流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2. 25色自然殺傷細(xì)胞流式方案的設(shè)門策略,。采用25色流式實(shí)驗(yàn)方案分析NK細(xì)胞,。首先圈出活的淋巴細(xì)胞，依次設(shè)門排除雙聯(lián)體,、死細(xì)胞和非NK細(xì)胞,。最后分析門內(nèi)具有特定表面標(biāo)志物的NK細(xì)胞。每種顏色對(duì)應(yīng)多色方案中使用的不同熒光標(biāo)記抗體,，從而對(duì)NK細(xì)胞亞群進(jìn)行精確鑒定與分析,。

圖3. 泛NK細(xì)胞標(biāo)志物。不同自然殺傷細(xì)胞亞群中 NKp30,、NKp46,、CD226 和 CD244 的表達(dá)情況。

圖4. 細(xì)胞刺激后泛 NK 細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)變化,。當(dāng)NK細(xì)胞用 100 IU/mL  IL-2,、10 ng/mL  IL-15 以及 25 ng/mL  IL-21 刺激過夜后，CD11b 或 CD161 的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化,。

圖5. NK細(xì)胞亞群中的活化標(biāo)志物,。成熟NK細(xì)胞群體中表達(dá)不同水平的成熟抗原。在病毒感染或腫瘤細(xì)胞的刺激過程中,，可追蹤 NKG2C,、CD2 和 CD38 等標(biāo)志物的表達(dá)變化情況。

圖6. NK細(xì)胞亞群中的抑制性抗原,。NKG2A,、KIR2DL1、KIR2DL2/3 和 KLRG1 的表達(dá)水平如圖所示，這些分子在響應(yīng)腫瘤和病毒感染時(shí)調(diào)控NK細(xì)胞的活化與功能,。

圖7. NK細(xì)胞中活化抗原的表達(dá),。當(dāng)PBMC受到刺激后，NK細(xì)胞多種活化標(biāo)志物的表達(dá)水平不盡相同,，如 TIGIT,、CD69 和 NKp46 。未成熟,、成熟及終末NK細(xì)胞的表達(dá)水平可能存在差異,。

圖8. 使用25色NK細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案準(zhǔn)確檢測(cè)稀有細(xì)胞亞群。使用Attune Xenith快速采集超過 100 萬個(gè)細(xì)胞 (流速：200 µL/分鐘),，用于分析未成熟,、成熟及終末NK細(xì)胞亞群。第一個(gè)圖展示了這些細(xì)胞亞群占細(xì)胞總數(shù)的百分比,。

光譜流式細(xì)胞術(shù)討論

光譜流式細(xì)胞術(shù)大大擴(kuò)展了流式實(shí)驗(yàn)可同時(shí)檢測(cè)的參數(shù)數(shù)量,，從而可以更深入地研究目標(biāo)細(xì)胞群體。本實(shí)驗(yàn)中我們采用 25 色流式方案對(duì)人PBMC中的各種NK細(xì)胞亞群進(jìn)行深入分析,。通過分析未成熟,、成熟及終末 NK 細(xì)胞亞群中關(guān)鍵標(biāo)志物的表達(dá)水平，以闡明 NK 細(xì)胞活化與抑制狀態(tài)的表型特征,。采用多種標(biāo)志物標(biāo)記經(jīng)細(xì)胞因子刺激和未刺激的人 PBMC,，結(jié)果顯示刺激后 NK 細(xì)胞亞群的活化指標(biāo)水平發(fā)生顯著變化，包括 CD69,、NKp46 等在內(nèi)的多個(gè)重要標(biāo)志物的表達(dá)水平與 NK 細(xì)胞在此類刺激條件下的預(yù)期相符,。這有效證實(shí)了 Attune Xenith全光譜流式細(xì)胞儀及應(yīng)用的多色流式方案能夠精確研究腫瘤免疫中這一重要免疫細(xì)胞譜系的能力。

Sasquatch 軟件工具和光譜解析結(jié)果表明,，該多色方案尚未充分發(fā)揮Attune Xenith系統(tǒng)的檢測(cè)潛力,。隨著光譜流式方案的不斷發(fā)展，后續(xù)研究可以更深入地探索 PBMC 樣本中非 NK 細(xì)胞的表型特征,，以及增加NK 細(xì)胞亞群中其他活化/抑制標(biāo)志物。這一持續(xù)改進(jìn)將進(jìn)一步提升該多色實(shí)驗(yàn)方案在更全面研究免疫細(xì)胞亞群方面的實(shí)用性,。

Attune Xenith 全光譜流式細(xì)胞儀

Invitrogen™ Attune™ Xenith™是賽默飛全新推出的一款快速且抗堵的全光譜流式細(xì)胞儀,，將聲波聚焦技術(shù)與全光譜解析功能結(jié)合，旨在為前沿的科學(xué)研究提供一種高效,、靈敏,、可靠的解決方案。

其主要技術(shù)優(yōu)勢(shì)為：

· 全光譜：配置高達(dá)6激光57參數(shù)

· 速度快：上樣速度比其他光譜流式儀快5倍

· 抗堵：專業(yè)抗堵塞設(shè)計(jì)

· 靈敏：尤其適合稀有細(xì)胞檢測(cè)

· 自動(dòng)化：配套流式自動(dòng)化工作站

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