通過結(jié)構(gòu)仿生與功能整合,，不僅為腸道感染機制研究提供了動態(tài)平臺,，還為抗菌藥物（尤其是噬菌體療法）的高通量篩選開辟了新路徑，其核心優(yōu)勢在于三維結(jié)構(gòu)誘導的組織功能化與快速生理響應(yīng)能力,，顯著提升了體外模型與體內(nèi)環(huán)境的一致性,。

一、腸道感染建模實驗步驟

1. 模型準備與細菌培養(yǎng)

- 組織模型構(gòu)建：將Caco-2與HT29-MTX-E12細胞按6:1比例接種于V-ECM（絨毛-隱窩仿生界面）,、F-ECM（平坦ECM界面）,，培養(yǎng)72小時形成完整上皮層。

- 細菌制備：使用大腸桿菌（E. coli）菌株（如ATCC BAA-2326™或ATCC 11303™）,，接種于LB瓊脂板37℃培養(yǎng)24小時,，收集菌落并調(diào)整菌液濃度至OD???=0.01或0.1。

2. 感染模型建立與動態(tài)監(jiān)測

- 感染接種：移除模型培養(yǎng)基,，加入含大腸桿菌的培養(yǎng)基,，共培養(yǎng)72小時，每24小時通過熒光顯微鏡觀察細菌與組織的互作（細菌用GFP標記,，細胞用CM-Dil染色）,。

- 覆蓋面積分析：利用ImageJ軟件量化GFP標記細菌在組織表面的覆蓋比例,，對比V-ECM與對照組的差異。

- 屏障功能評估：通過電化學阻抗譜（EIS）測量跨上皮電阻（TEER）,，感染后TEER值的變化反映組織屏障完整性,。V-ECM組在感染后TEER反而升高，而F-ECM組顯著下降,。

3. 細菌定植與侵襲能力檢測

- 菌落計數(shù)（CFU）：收集培養(yǎng)介質(zhì)（浮游菌）和刮取組織表面（黏附菌）,，梯度稀釋后接種于LB平板，計算CFU/mL,。V-ECM組黏附菌數(shù)量顯著低于對照組,。

- 侵襲實驗：采用慶大霉素保護法，感染后用慶大霉素殺死胞外菌,，裂解細胞后培養(yǎng)計數(shù),，評估細菌侵襲組織的能力。V-ECM組侵襲菌比例僅為0.1%,，遠低于F-ECM的3.7%,。

4. 抗菌機制驗證

- 抗菌肽（AMPs）檢測：通過ELISA測定感染后組織分泌的人β-防御素2（HBD2），V-ECM組感染后HBD2分泌量顯著升高,。

- 基因表達分析：RT-PCR檢測AMPs相關(guān)基因（如DEFB4A,、DEFB103B）及炎癥因子（IL-1α、TNF）,，V-ECM組AMPs基因上調(diào),，而對照組促炎基因激活。

- 黏膜屏障觀察：Alcian Blue染色顯示V-ECM組黏膜層覆蓋面積達81.28%,，而F-ECM組僅11.32%，黏液層的完整性抑制了細菌黏附,。

二,、抗菌藥物篩選實驗步驟

1. 耐藥菌感染模型構(gòu)建

- 耐藥菌制備：將大腸桿菌轉(zhuǎn)化為卡那霉素（Kan）耐藥株（如攜帶mini-Tn7-kan-gfp質(zhì)粒），調(diào)整OD???=0.1用于感染,。

- 感染預(yù)處理：V-ECM模型培養(yǎng)72小時后,，接種耐藥菌4小時，隨后更換含藥物的培養(yǎng)基,。

2. 藥物處理與效果對比

- 藥物設(shè)置：實驗組分為T4噬菌體組（10? PFU/mL）,、Kan組（100 μg/mL）及對照組（無藥）。

- 動態(tài)監(jiān)測：每8小時取樣,，熒光顯微鏡觀察細菌覆蓋面積,，CFU計數(shù)評估細菌數(shù)量變化。T4噬菌體組24小時內(nèi)細菌覆蓋從84%降至接近0,，而Kan組無明顯效果,。

3. 噬菌體增殖與抗菌機制分析

- 噬菌斑檢測：收集T4噬菌體處理后的培養(yǎng)基,，梯度稀釋后接種于雙層瓊脂，觀察噬菌斑形成,。24小時后噬菌斑數(shù)量增加約100倍,，表明噬菌體在感染部位增殖。

- 電鏡觀察：透射電鏡（TEM）顯示T4噬菌體吸附于細菌表面并導致菌體裂解,，而Kan處理組細菌膜結(jié)構(gòu)完整,。

- 多重感染指數(shù)（MOI）：計算噬菌體與細菌的比例，T4組MOI在24小時內(nèi)從1:1升至10?:1,，形成“自擴增”抗菌效應(yīng),。

三、關(guān)鍵技術(shù)優(yōu)勢與實驗驗證

1. 模型性能對比

2. 創(chuàng)新點與應(yīng)用價值

- 快速篩選平臺：24小時內(nèi)完成抗菌效果評估,，較傳統(tǒng)方法（需數(shù)周）大幅縮短周期,。

- 仿生機制模擬：絨毛-隱窩結(jié)構(gòu)促進黏液層與AMP協(xié)同作用，更貼近體內(nèi)抗菌機制,。

- 耐藥菌治療潛力：噬菌體在V-ECM模型中可自我擴增,，為AMR（抗微生物藥物耐藥性）感染提供新策略。

作者將 3D 仿生腸道絨毛模型應(yīng)用于腸道感染建模和抗菌藥物篩選,。研究人員以大腸桿菌（E. coli）為模型病原體,，比較了該模型與傳統(tǒng) 2D 培養(yǎng)模型在感染過程中的差異。

實驗結(jié)果顯示,，在仿生界面上培養(yǎng)的類器官能夠有效抵抗大腸桿菌的感染,。與對照組相比，其表面的細菌定植和生物膜形成明顯減少,，這主要歸因于類器官分泌的天然抗菌肽（AMPs）水平升高,。進一步的機制研究表明，仿生界面的結(jié)構(gòu)特征促進了杯狀細胞的分化和黏蛋白的分泌,，形成了有效的黏膜屏障,，從而抑制了病原體的黏附和入侵。

基于該模型的良好性能,，研究人員還進行了抗菌藥物篩選實驗,。他們比較了傳統(tǒng)抗生素卡那霉素和噬菌體 T4 對耐藥大腸桿菌的治療效果。結(jié)果顯示,，噬菌體 T4 能夠在 24 小時內(nèi)顯著降低細菌數(shù)量,，而卡那霉素則由于細菌耐藥性而效果不佳。這一結(jié)果不僅驗證了該模型在抗菌藥物篩選中的實用性,，也為耐藥菌感染的治療提供了新的思路,。

四、實驗拓展與未來方向

- 微流控整合：將V-ECM模型接入英國Kirkstall Quasi Vivo器官芯片（OoC）,，模擬腸道蠕動流場,，評估動態(tài)剪切力對感染與藥物效果的影響,。

- 共培養(yǎng)系統(tǒng)：構(gòu)建英國Kirkstall Quasi Vivo雙腔器官芯片（OoC），上層腸道組織+下層血管內(nèi)皮細胞,，研究病原體跨屏障侵襲與免疫細胞互作,。

- 原代類器官驗證：使用患者來源的腸道類器官（hIOs）接種于V-ECM，提升模型臨床轉(zhuǎn)化價值,。

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