奧林巴斯倒置CKX53顯微鏡觀察細(xì)菌在網(wǎng)格計數(shù)板
奧林巴斯倒置CKX53顯微鏡結(jié)合網(wǎng)格計數(shù)板是觀察和計數(shù)細(xì)菌的常用組合,其操作簡便,、成像清晰,,適用于微生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)及工業(yè)發(fā)酵等領(lǐng)域的細(xì)菌定量分析,。以下從設(shè)備準(zhǔn)備,、樣本處理、觀察計數(shù)及注意事項四個方面進(jìn)行系統(tǒng)性說明:
一,、設(shè)備與材料準(zhǔn)備
顯微鏡配置
奧林巴斯CKX53倒置顯微鏡:
光源:優(yōu)先選用LED光源(如CKX-LED),,提供穩(wěn)定均勻的照明,減少熱量對細(xì)菌活性的影響,。
物鏡:根據(jù)細(xì)菌大小選擇10×,、20×或40×物鏡(NA≥0.25),確保視野清晰且覆蓋網(wǎng)格區(qū)域,。
目鏡:10×目鏡(視野直徑約1.8-2.0mm)適合常規(guī)計數(shù),,若需更高精度可換用15×或20×目鏡。
網(wǎng)格計數(shù)板:
類型:常用血細(xì)胞計數(shù)板(如Neubauer改進(jìn)型)或?qū)S眉?xì)菌計數(shù)板(如Petroff-Hausser計數(shù)室)。
規(guī)格:
Neubauer計數(shù)板:中央?yún)^(qū)域分為25個中方格,,每個中方格含16個小方格(邊長0.2mm,,面積0.04mm2),深度0.1mm(體積0.004mm3=0.000004mL),。
細(xì)菌專用計數(shù)板:網(wǎng)格更細(xì)(如0.02mm2/小方格),,適合高密度樣本。
輔助工具
蓋玻片(厚度0.17mm),、載玻片(可選),、移液器(10μL量程)、無菌吸頭,、酒精棉球,、記號筆。
二,、樣本處理與制片
樣本稀釋
目的:將細(xì)菌濃度調(diào)整至20-200個/中方格(Neubauer計數(shù)板)或50-150個/小方格(細(xì)菌專用板),,避免過度密集或稀疏。
方法:
初步估算濃度:取10μL樣本與990μL無菌水混合(1:100稀釋),,重復(fù)稀釋至合適范圍。
制片步驟
清潔計數(shù)板:用酒精棉球擦拭計數(shù)板和蓋玻片,,晾干后避免指紋污染,。
蓋玻片放置:將蓋玻片輕壓在計數(shù)室上,確保無氣泡且邊緣密封(防止樣本溢出),。
加樣:用移液器吸取10μL稀釋后的樣本,,從計數(shù)室邊緣緩慢注入,利用毛細(xì)作用使樣本均勻填充計數(shù)室,。
靜置:等待2-3分鐘使細(xì)菌沉降,,避免移動計數(shù)板導(dǎo)致分布不均。
三,、顯微鏡觀察與計數(shù)
顯微鏡設(shè)置
對焦:切換至相差模式(若CKX53配備相差附件)或明場模式,,調(diào)節(jié)粗/細(xì)準(zhǔn)焦螺旋使網(wǎng)格線清晰可見。
光源調(diào)整:降低光源強度至適中(避免熒光干擾或細(xì)菌光損傷),,關(guān)閉聚光鏡虹彩光圈以減少眩光,。
視野選擇:優(yōu)先計數(shù)中央?yún)^(qū)域(如Neubauer計數(shù)板的4個角及中央共5個中方格),減少邊緣效應(yīng),。
計數(shù)規(guī)則
邊界處理:對壓線細(xì)菌采用“數(shù)上不數(shù)下,、數(shù)左不數(shù)右”原則(或統(tǒng)一計數(shù)上邊和左邊的細(xì)菌)。
死菌區(qū)分:若需區(qū)分活菌與死菌,,可提前用臺盼藍(lán)染色(活菌拒染,,死菌染藍(lán)),或通過形態(tài)差異(如破碎細(xì)胞)判斷,。
重復(fù)計數(shù):對同一樣本重復(fù)計數(shù)2-3次,,取平均值以提高準(zhǔn)確性,。
四、注意事項與優(yōu)化技巧
避免誤差來源
樣本均勻性:稀釋后充分混勻,,避免細(xì)菌沉降導(dǎo)致濃度不均,。
網(wǎng)格對齊:確保計數(shù)板網(wǎng)格與顯微鏡視野十字線平行,減少計數(shù)偏差,。
時間控制:計數(shù)應(yīng)在樣本制備后30分鐘內(nèi)完成,,防止細(xì)菌繁殖或死亡影響結(jié)果。
特殊場景處理
高密度樣本:進(jìn)一步稀釋至可計數(shù)范圍,,或改用熒光染色結(jié)合自動計數(shù)軟件(如ImageJ的Cell Counter插件),。
運動性細(xì)菌:在樣本中加入少量甲醛(終濃度0.5%)固定細(xì)菌,或使用瓊脂覆蓋法限制運動,。
鏈狀/簇狀細(xì)菌:記錄鏈或簇的數(shù)量,,按單個細(xì)菌計算(或根據(jù)研究需求調(diào)整規(guī)則)。
設(shè)備維護(hù)
清潔:使用后用壓縮空氣吹除計數(shù)板殘留樣本,,避免腐蝕金屬部件,。
校準(zhǔn):定期檢查顯微鏡光源強度、物鏡分辨率及網(wǎng)格計數(shù)板精度(如通過標(biāo)準(zhǔn)微球驗證),。
五,、應(yīng)用案例
發(fā)酵工業(yè):監(jiān)測乳酸菌發(fā)酵過程中的活菌數(shù)變化,優(yōu)化發(fā)酵條件(如pH,、溫度),。
環(huán)境監(jiān)測:計數(shù)水體中的大腸桿菌群落,評估水質(zhì)污染程度,。
臨床診斷:快速檢測尿液或血液中的病原菌濃度,,指導(dǎo)抗生素用藥劑量。
通過規(guī)范操作和細(xì)節(jié)優(yōu)化,,奧林巴斯CKX53顯微鏡結(jié)合網(wǎng)格計數(shù)板可實現(xiàn)細(xì)菌濃度的快速,、準(zhǔn)確測定,為微生物研究提供可靠數(shù)據(jù)支持,。
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