使用 Gibco 細(xì)胞解離試劑來分離貼壁細(xì)胞和組織

為了獲得合適數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行研究,，必須先從較大培養(yǎng)物中分離出一組細(xì)胞,。進(jìn)入：細(xì)胞解離,。Gibco 胰蛋白酶和替代細(xì)胞解離產(chǎn)品是組織和單層細(xì)胞的理想之選,。提供多種形式，包括酶促和化學(xué)形式,，以滿足研究人員進(jìn)行貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的不同需求,。探索以下選擇指南，為您的細(xì)胞培養(yǎng)類型選擇正確的細(xì)胞解離試劑,。

胰蛋白酶和細(xì)胞蛋白酶化

胰蛋白酶是一種蛋白水解酶,，是分離貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物和單層細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法。這種球狀胰腺蛋白酶在賴氨酸和精氨酸的 C 端裂解,，分解血管粘附蛋白，并可在細(xì)胞收獲過程中輕易重懸,。

賽默飛世爾科技提供豬胰蛋白酶,，EDTA 增強(qiáng)胰蛋白酶以及 TrypLE 酶制劑的配方，這是一種溫和的胰蛋白酶樣酶,。為避免計劃外的蛋白質(zhì)降解,，必須使用胰蛋白酶抑制劑滅活有機(jī)胰蛋白酶。相比之下,，合成胰蛋白酶（如 Gibco TrypLE 產(chǎn)品）通過稀釋滅活,，無需額外的溶液。

注：如果細(xì)胞培養(yǎng)基中含胎牛血清（FBS）,，在胰蛋白酶化之前需要用平衡鹽溶液清洗培養(yǎng)物,，以確保胰蛋白酶的功能,。

胰蛋白酶-EDTA  

EDTA 是一種螯合劑，可提高胰蛋白酶分離貼壁細(xì)胞的能力,。EDTA 將鈣和鎂結(jié)合成六齒結(jié)構(gòu),，削弱細(xì)胞間粘附，增強(qiáng)胰蛋白酶對水解靶向肽鍵的獲取,。

Gibco 胰蛋白酶-EDTA 由經(jīng)過電子束驗(yàn)證的輻照豬源蛋白酶制成,，并經(jīng)過 PPV、支原體和 PCV 1/2 污染測試,。

幫助實(shí)現(xiàn)與 TrypLE 試劑的溫和細(xì)胞解離

Gibco TrypLE 試劑是高度純化的重組細(xì)胞解離酶,，可替代豬胰蛋白酶。這些試劑非常適合在含血清和無血清條件下解離貼壁依賴細(xì)胞系,，無需更改方案即可直接替代胰蛋白酶,。TrypLE 試劑對細(xì)胞溫和，在室溫下穩(wěn)定,，無動物源性,。

TrypLE 酶是血清添加和不含血清條件的理想選擇,，是無動物源性胰蛋白酶樣酶的答案。這種酶表現(xiàn)出與胰蛋白酶相似的 pH 值活性譜,，在精氨酸和賴氨酸處裂解,。由于 TrypLE 酶的無動物來源,，消除了潛在致病污染物的危害；并經(jīng)過受控的發(fā)酵過程,，TrypLE 酶可以在任何規(guī)模下供應(yīng),。

查看比較圖：胰蛋白酶,、胰蛋白酶 EDTA 與 TrypLE 試劑

胰蛋白酶抑制劑

胰蛋白酶抑制劑破壞性地改變胰蛋白酶，使蛋白水解酶與蛋白質(zhì)結(jié)合并消化蛋白質(zhì)的能力失效。胰蛋白酶抑制劑用于解離后,，保護(hù)細(xì)胞免受胰蛋白酶進(jìn)一步的蛋白質(zhì)降解,。

注：大豆胰蛋白酶抑制劑也可結(jié)合胰凝乳蛋白酶，盡管程度較小。

胰蛋白酶抑制劑比較圖

膠原酶

相對溫和的膠原酶以通過消化結(jié)締組織的天然三螺旋膠原纖維而起其作用,。這些組織通常存在于皮膚,、肌腱、血管和骨骼中—因此膠原酶解聚適用于人類腫瘤,、小鼠腎臟,、人腦和上皮培養(yǎng)物。

從原代組織中進(jìn)行細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品和步驟：

TrypLE™ 產(chǎn)品

TrypLE™ 產(chǎn)品的配方可直接替代您現(xiàn)有的方案,。下列通用步驟可用于去除培養(yǎng)皿中多種細(xì)胞系,，同時保持細(xì)胞完整性,。應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定各系統(tǒng)可采用的優(yōu)化條件和濃度,。

1. 從培養(yǎng)瓶中慢慢倒出培養(yǎng)基,。使用不含鈣和鎂的 5 ml Dulbecco 磷酸緩沖鹽溶液 (D-PBS) 來沖洗培養(yǎng)瓶（Gibco 貨號 14190）。慢慢倒出 D-PBS,。

2. 向培養(yǎng)瓶加入適量（即在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中加入 2 ml）且預(yù)熱的 TrypLE™,。搖動容器,，以覆蓋細(xì)胞層,。

3. 37°C 下孵育直至細(xì)胞分離（每 5 分鐘觀察一次）,。輕輕敲打容器以清除細(xì)胞,。

4. 用 2 至 5 ml 細(xì)胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 15 ml 離心管中。

5. 以 100 × g 離心 5 到 10 分鐘,。丟棄上清液,，用 2 至 5 ml 新鮮生長培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀。

胰蛋白酶

1. 去掉多余的組織后,，使用無菌手術(shù)刀或剪刀,，將剩余組織切成 3-4 mm 的小塊,。將組織塊重懸于不含鈣和鎂的平衡鹽溶液中，進(jìn)行洗滌,。待組織塊沉降，去除上清液,。重復(fù)洗滌 2 到 3 次,。

2. 將盛有組織塊的容器置于冰上，去除殘留的上清液,。在 不含鈣和鎂的平衡鹽溶液中加入 0.25% 的胰蛋白酶（100 mg 組織加入 1 ml 胰蛋白酶）,。

3. 在 4°C 下孵育 6 至 18 小時,，以大幅度地增加幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶的滲透率,。

4. 慢慢倒出并丟棄組織塊中的胰蛋白酶,。將組織塊以及殘留胰蛋白酶在 37°C 下孵育 20 至 30 分鐘,。

5. 向組織塊中加入溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基，用移液管上下吹吸輕輕分散組織,。如果使用無血清培養(yǎng)基，還要加入大豆胰蛋白酶抑制劑,。

6. 通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)（100 至 200 µm）過濾細(xì)胞懸液,，分散剩余組織,。計數(shù)和接種細(xì)胞,，進(jìn)行培養(yǎng)。

膠原酶

1. 使用無菌手術(shù)刀或剪刀,，將組織切成 3-4 mm 的小塊,。使用 Hanks 平衡鹽溶液 (HBSS) 洗滌組織塊數(shù)次。

2. 加入膠原酶（50 至 200 單位/ml,，溶解在 HBSS 中）,。

3. 在 37°C 下孵育 4 至 18 小時。加入 3 mM CaCl2 可增加解離效率,。

4. 通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液,，將分散細(xì)胞和組織碎片與較大的組織塊分開,。如果需要進(jìn)一步的解聚 ，在組織塊中加入新鮮的膠原酶,。

5. 通過離心在 HBSS 中洗滌懸液數(shù)次,。

6. 將細(xì)胞沉淀重懸于培養(yǎng)基中。計數(shù)和接種細(xì)胞,，進(jìn)行培養(yǎng),。

分散酶

1. 使用無菌手術(shù)刀或剪刀，將組織切成 3-4 mm 的小塊,。使用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液洗滌組織塊數(shù)次。

2. 加入分散酶（0.6 至 2.4 單位/ml,，溶解在不含鈣和鎂的平衡鹽溶液中）,。

3. 在 37°C 下孵育 20 分鐘至數(shù)小時。

4. 通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液,，將分散細(xì)胞和組織碎片與較大的組織塊分開,。如果需要進(jìn)一步 的解聚，在組織塊中加入新鮮的分散酶,。

5. 通過離心在平衡鹽溶液中洗滌懸液數(shù)次,。

為您的細(xì)胞類型選擇正確的膠原酶

分散酶

分散酶或中性蛋白酶是多粘芽孢桿菌產(chǎn)生的金屬酶?？焖?、溫和的分散酶可用于收獲和轉(zhuǎn)移正常的二倍體細(xì)胞和細(xì)胞系。分散酶可有效分離細(xì)胞團(tuán)塊并從完整組織中分裂細(xì)胞,，對膜完整性或活力幾乎沒有影響,。

非酶細(xì)胞解離

Versene 溶液

Versene 溶液是 PBS 中的 EDTA 溶液，可溫和,、非酶地解離細(xì)胞,。這種螯合劑將某些細(xì)胞類型（如上皮細(xì)胞）從血管表面分離以進(jìn)行懸浮。也可以用作胰蛋白酶消化前的洗滌劑,。

非酶細(xì)胞解離緩沖液

推薦用于弱貼壁細(xì)胞（如上皮細(xì)胞）,，Gibco 細(xì)胞解離緩沖液可溫和解離并保持表面蛋白完整性。適合的應(yīng)用包括參與配體結(jié)合的細(xì)胞,、流式細(xì)胞和免疫組織化學(xué)研究,。

無酶細(xì)胞解離緩沖液實(shí)驗(yàn)方案：

以下是從基質(zhì)中快速移取各種細(xì)胞系同時保持細(xì)胞完整性的一種常規(guī)程序。此程序并不普遍適用于所有細(xì)胞系,。應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定各系統(tǒng)的條件和濃度,。 在傳代培養(yǎng)時，應(yīng)定期監(jiān)測細(xì)胞活力,。細(xì)胞活力應(yīng)大于 90%,。

1. 使用前將所有試劑加熱至 37°C,。

2. 去除細(xì)胞中的生長培養(yǎng)基。

3. 沖洗單層細(xì)胞,，每個 T75 培養(yǎng)瓶或 100 mm 培養(yǎng)皿使用 5 ml 不含 Ca++ 和 Mg++ 的 PBS,。輕輕搖動培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)皿），使溶液在室溫下將細(xì)胞洗滌30至60秒,。吸出沖洗液并丟棄,。

4. 重復(fù)步驟3。

5. 每個 T75 培養(yǎng)瓶或 100 mm 培養(yǎng)皿中加入大約 5 ml 細(xì)胞解離緩沖液,，然后通過在室溫下?lián)u動來輕柔地將細(xì)胞洗滌1至2分鐘,。您可以在顯微鏡下觀察解離情況。 吸出溶液并丟棄,。

6. 用手掌用力拍打培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿,，使細(xì)胞脫落。如果細(xì)胞不能快速脫附,，則在室溫下再放置2至5分鐘,，再次用手掌用力拍打培養(yǎng)瓶。對于貼壁能力更強(qiáng)的細(xì)胞（使用 5 ml 以上的解離緩沖液）,，可能需要重復(fù)此操作,。細(xì)胞明顯脫附后，加入至少 5 ml 生長培養(yǎng)基,。將細(xì)胞重懸于生長培養(yǎng)基中,。

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