試劑的準備

按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑,。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的,。自配的緩沖液,、洗滌液應用pH計測量。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用,，一般室溫平衡不低于30min,。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。

加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚,，即加標本,，加酶結合物，加底物,。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,，不可產生氣泡,。

加標本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中,。每次加標本應更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣（一般不建議使用）,。有些指標檢測（如間接法ELISA）需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,，再在其中加入血清標本,，然后在微型震蕩器上震蕩1min,。加酶結合物工作液和底物工作液時可用多道移液器，使加液過程在最短時間內完成,。

保溫

在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應,，即加標本和加酶結合物后?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時間,，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育,。

ELISA屬固相免疫測定,，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會,，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點,。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此,。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。

溫育常采用的溫度有43℃,、37℃,、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結合的合適溫度,。在建立ELISA方法作反應動力學研究時，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時,，產物的生成可達成,。為加速反應，可提高反應的溫度,，有些試驗在43℃進行,，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應4℃,，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀,。但因所需時間太長,，在ELISA中一般不予采用。

保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外,，一般均采用水浴,，可將ELISA板置于水浴箱中,，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡,。為避免蒸發(fā),，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,，此時可讓反應板漂浮在水面上,。若用保溫箱，ELISA板應放在濕盒內,，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上,。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規(guī)定的溫度,，特別是在氣溫較低的時候更應如此。為避免酶標板底部受水汽或磨損導致的讀數(shù)誤差,，一般采用鼓風恒溫箱保溫,，這個過程必須在酶標板上方貼封紙，以免蒸發(fā),。無論是水浴還是濕盒溫育,，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內,，標準室溫溫度是指20-25℃,，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時,，ELISA板只要平置于操作臺上即可,。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。為保證時間精確,，一個人一次不宜多于兩塊板同時操作,、測定。