鐵死亡檢測方法指南:關(guān)鍵標(biāo)志物分析與染色方法指南 | MCE
檢測鐵死亡的方法包括:檢測代謝反應(yīng)(如脂代謝,、鐵代謝和 GSH 相關(guān)代謝)相關(guān)標(biāo)志物含量變化,、細(xì)胞形態(tài)變化、和分子蛋白含量/活性變化,。
01
脂代謝相關(guān)生物標(biāo)志物檢測
過度的脂質(zhì)過氧化通過產(chǎn)生有毒的磷脂氫過氧化物(PLOOH),,在促進(jìn)鐵死亡中起著重要作用,。因此,脂質(zhì)過氧化相關(guān)的生物標(biāo)志物是鐵死亡的關(guān)鍵檢測指標(biāo),。
1.1 脂質(zhì)過氧化物檢測
BODIPY 581/591 C11 是一種脂溶性比率型熒光探針,,能夠嵌入細(xì)胞膜并與細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)相互作用。在未氧化狀態(tài)下,,呈現(xiàn)紅色熒光 (還原型,;Ex=581 nm, Em=591 nm)。
當(dāng)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時,,亞鐵離子 (Fe2+) 和 ROS 促進(jìn)脂質(zhì)氧化,,形成脂質(zhì)過氧化物,BODIPY 581/591 C11 被氧化,,發(fā)射波長從 591 nm 轉(zhuǎn)移到 510 nm,,產(chǎn)生綠色熒光 (氧化型;Ex=500 nm, Em=510 nm),。
需要注意的是,,BODIPY 581/591 C11 對脂溶性膜內(nèi)各種活性氧 (ROS) 和過氧亞硝酸鹽 (ONOO-) 也較為敏感,因此它也可以用于鐵死亡細(xì)胞中 ROS 和 RNS 的檢測,。
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MCE 熱銷產(chǎn)品
Cat. No. | Product Name | Application |
HY-D1301 | BODIPY 581/591 C11 | 比率型熒光探針,; 健康細(xì)胞:紅色熒光 (Ex/Em=581/591 nm); 鐵死亡細(xì)胞:綠色熒光 (Ex/Em=500/510 nm) |
HY-D1412 | LPd peroxida probe | 健康細(xì)胞:微弱的綠色熒光,; 鐵死亡細(xì)胞:更為明亮的綠色熒光 (Ex/Em=524/535 nm) |
HY-125623 | MitoPerOx | 檢測線粒體脂質(zhì)過氧化,; 健康細(xì)胞:微弱的綠色熒光; 鐵死亡細(xì)胞:更為明亮的綠色熒光 (Ex/Em=485/520 nm) |
BODIPY 581/591 C11 染色參考
1. 儲備液及工作液的制備:
(1) 用 DMSO 配制 10 mM BODIPY 581/591 C11 儲備液(-20°C 或 -80°C 避光保存,,避免反復(fù)凍融),。
(2) 染色前用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 稀釋儲備液,制備 2-10 μM BODIPY 581/591 C11 工作液
(請根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整工作液濃度),。
2. 細(xì)胞染色:
(1) 細(xì)胞制備
懸浮細(xì)胞:4°C, 1000 ×g 離心 3-5 分鐘,,棄上清。PBS 洗 2 次,,每次 5 分鐘,。
貼壁細(xì)胞:棄去培養(yǎng)基,加入胰蛋白酶解離細(xì)胞,,制成單細(xì)胞懸液。4°C, 1000 ×g 離心 3-5 分鐘,,棄上清,。
PBS 洗 2 次,每次 5 分鐘,。
(2) 加入 1 mL BODIPY 581/591 C11 工作液,,室溫孵育 30 分鐘,。
(3) 4°C, 400 ×g 離心 3-4 分鐘,棄上清,。PBS 洗 2 次,,每次 5 分鐘。
(4) 用 1 mL 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 重懸細(xì)胞,,熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測,。
1.2 活性氧的檢測[20]
活性氧(ROS) 在鐵死亡過程中不僅促進(jìn)脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞損傷,還抑制抗氧化信號通路,,是鐵死亡檢測的重要生物標(biāo)志物,。H2DCFDA(DCFH-DA)是一種可滲透細(xì)胞的活性氧探針。進(jìn)入細(xì)胞后,,H2DCFDA 在細(xì)胞內(nèi)脫酯化,,并被 ROS 氧化成具有強(qiáng)烈熒光的 DCF,產(chǎn)生綠色熒光(Ex: 488 nm, Em: 525 nm),。通過熒光顯微鏡,、流式細(xì)胞儀或分光光度計等設(shè)備可以檢測細(xì)胞內(nèi) ROS 水平。
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H2DCFDA 染色方法參考
1. 儲備液及工作液的制備 :
(1) 用DMSO配制5mM的H2DCFDA儲備液(-20°C或 -80°C避光保存,,避免反復(fù)凍融),。
(2) 染色前用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS稀釋儲備液,配制成1-10μM的H2DCFDA工作液,。
(請根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整工作液濃度),。
2. 細(xì)胞染色:
(1) 懸浮細(xì)胞
· 離心收集細(xì)胞,保持密度約為1×106
個,。PBS洗滌兩次,,每次5分鐘。
· 加入1mL 染料工作液,,室溫孵育5-30分鐘,。
· 400×g離心3-4分鐘,棄上清,。PBS洗滌細(xì)胞兩次,,每次5分鐘。
· 用1mL無血清培養(yǎng)基或PBS重懸細(xì)胞,,使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察,。
(2) 貼壁細(xì)胞
· 將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于無菌蓋玻片上。
· 從培養(yǎng)基中移出蓋玻片,,置于載玻片上,,吸除多余培養(yǎng)基。加入 100 μL 染料工作液,,
輕輕晃動使其完-全覆蓋細(xì)胞,,孵育 5-30 分鐘,。
· 吸去染料工作液,培養(yǎng)基洗 2-3 次,,每次 5 分鐘,,使用熒光顯微鏡觀察。
注:若需要用流式細(xì)胞儀檢測,,需將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并重懸后再進(jìn)行染色,。
MCE 熱銷產(chǎn)品
Cat. No. | Product Name | Application |
HY-D0940
| H2DCFDA
| 健康細(xì)胞: 微弱的綠色熒光 鐵死亡細(xì)胞: 更為明亮的綠色熒光 (Ex/Em=488/525 nm)
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HY-K0320
|
ROS Assay Kit | 原理同 H2DCFDA; 提供陽性對照試劑 (Rosup)
|
HY-D0079
| Dihydroethidium (DHE)
| 健康細(xì)胞: 藍(lán)色熒光 (Ex/Em=370/420 nm); 鐵死亡細(xì)胞: 紅色熒光 (Ex/Em=535/610 nm)
|
1.3 過氧化脂質(zhì)衍生物的檢測[21][22]
脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中,大量的脂質(zhì)過氧化初級產(chǎn)物在氧化反應(yīng)中逐漸分解為一系列復(fù)雜的醛類化合物,,包括 MDA,,4-HNE,丙醛和己醛等,。這些活性醛類物質(zhì)能夠攻擊蛋白質(zhì)等生物大分子,,形成加合物,從而引發(fā)細(xì)胞的進(jìn)一步損傷,。
Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit 是一種基于硫代巴比-妥酸 (TBA) 反應(yīng)物法的試劑盒,,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA 與 TBA 在高溫和酸性條件下反應(yīng),形成一種具有特定顏色的 MDA-TBA 復(fù)合物,,其最大吸收波長通常在 532 nm 處,,可通過比色法來定量檢測脂質(zhì)過氧化水平。
此外,,4-HNE 抗體可以用來定量檢測 4-HNE 水平,。需要注意的是,MDA 和 4-HNE 在除鐵死亡外的多種氧化應(yīng)激狀態(tài)下均可產(chǎn)生,,在實(shí)際應(yīng)用中,,一般與其他檢測方法進(jìn)行相互驗(yàn)證,以提高結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性[10],。
MCE 熱銷產(chǎn)品
Cat. No. | Product Name | Biomarker detection | Application |
HY-77962 | 2-Thiobarbituric acid (TBA) | MDA | TBA 與 MDA 形成絡(luò)合物,,可通過比色法測定 (OD=532 nm) |
HY-K0319 | Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | MDA | 試劑盒中 TBA 與 MDA 反應(yīng)生成 MDA-TBA 復(fù)合物,可通過比色法(OD=532 nm) 或熒光法(Ex/Em=532/553 nm)進(jìn)行定量檢測,; 內(nèi)含 MDA 標(biāo)準(zhǔn)品,; 可用于血漿、血清,、尿液,、組織及細(xì)胞中MDA含量檢測 |
HY-P81208 | 4 Hydroxynonenal (4-HNE) 抗體 | 兔來源、抗 4-HNE 多克隆抗體,; 可用于 WB,,ELISA,IHC-P,,IF 實(shí)驗(yàn) |
02
鐵代謝相關(guān)生物標(biāo)志物檢測[23]
在鐵死亡過程中,,細(xì)胞內(nèi) Fe2+的積累會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加,從而促進(jìn)脂質(zhì)過氧化,。因此,,細(xì)胞鐵含量或者 Fe2+/Fe3+ 比值的測定可作為鐵死亡監(jiān)測的重要指標(biāo)。FerroOrange 是一種特異性 Fe2+ 探針,,可與 Fe2+ 結(jié)合形成橙紅色熒光復(fù)合物,。通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)檢測 (Ex/Em: 542/572 nm),可以實(shí)現(xiàn)定量分析細(xì)胞內(nèi) Fe2+ 的濃度,。
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MCE 熱銷產(chǎn)品
Cat. No. | Product Name | Application |
HY-D1913
| FerroOrange
| Fe2+ 探針,; 橙色熒光 (Ex/Em: 542/572 nm)
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HY-D2295
| Mito-FerroGreen
| 線粒體特異性 Fe2+ 探針; 綠色熒光 (Ex/Em: 488/535 nm)
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HY-D1533
| RhoNox-1
| Fe2+ 探針,; 橙 (紅色) 熒光 (Ex/Em: 540/575 nm)
|
03
谷胱甘肽代謝相關(guān)生物標(biāo)志物檢測
谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化,。在鐵死亡過程中,GSH 水平顯著下降,,可導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化能力減弱,,進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)過氧化物的積累。因此,,檢測 GSH 相關(guān)代謝等指標(biāo)可用于監(jiān)測鐵死亡的過程,。
3.1 GSH 含量檢測[24]
比色法,熒光探針法,,ELISA,,HPLC 和質(zhì)譜等方法都可以用來檢測 GSH 含量。例如,,GSH/GSSG Assay Kit是一種基于二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)法的 GSH 含量檢測試劑盒,,DTNB 能夠與還原型 GSH 發(fā)生特異性反應(yīng)形成一種黃色的化合物?硫代二硝基苯酮(TNB),同時釋放出氧化型 GSH(GSSG),。生成的 TNB 在 405 nm 波長下具有強(qiáng)吸收,,可以通過比色法測定。
此外,,Monochlorobimane 等 GSH 熒光探針也可用來檢測 GSH 含量變化,。
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Cat. No. | Product Name | Application |
HY-K0311 | GSH/GSSG Assay Kit | 適用于全血、血漿,、血清,、尿液以及組織和細(xì)胞提取物樣本; 比色法檢測 GSH/GSSG 比值 (OD: 405 nm) |
HY-108715 | Real Thiol | GSH 熒光探針 (Ex/Em: 405/487 nm 和 488/562 nm),; F405/F488 的熒光強(qiáng)度比值反應(yīng)了 GSH 濃度 |
HY-108715A | RT-AM | Real thiol 前體活性分子,,定量監(jiān)測活細(xì)胞中 GSH 動態(tài)變化; GSH 熒光探針 (Ex/Em: 405/487 nm 和 488/562 nm),; F405/F488 的熒光強(qiáng)度比值反應(yīng)了 GSH 濃度 |
HY-101899 | Monochlorobimane | GSH 熒光探針 (Ex/Em: 380/470 nm) |
3.2 胱氨酸攝取活性檢測[26]
System xc-以 1:1 的比例用胞內(nèi)谷氨酸來換取胞外胱氨酸(Cys2)的輸入,,隨后被還原為為半胱氨酸(Cys),。抑制System xc-的活性會抑制胱氨酸的吸收,影響 GSH 的合成,,導(dǎo)致 GPX4 活性降低,,促進(jìn)鐵死亡。因此,,胱氨酸攝取活性可作為表征 System xc- 活性的檢測指標(biāo),,可通過 Cys 探針檢測胞內(nèi) Cys 含量。
04
細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的形態(tài)學(xué)檢測
4.1 細(xì)胞形態(tài)
鐵死亡細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征包括質(zhì)膜完整性喪失,、細(xì)胞膜破裂,、線粒體萎-縮、線粒體外膜破裂,、嵴減少或缺失和膜密度增加(Figure 9),,可通過透射電子顯微鏡(TEM)檢測。TEM 的主要缺點(diǎn)是:樣本制備過程繁瑣,,需要進(jìn)行脫水,、包埋和切片等步驟,可能導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的改變,,從而影響觀察結(jié)果,。
電鏡分析方法參考[27]
1. 樣品固定:用 2% 戊二醛(0.1 M 磷酸鹽緩沖液,pH 7.4)固定細(xì)胞,。
2. 脫水并包埋:2% OsO4 固定細(xì)胞切片后,,用乙醇脫水,包埋在 Epok 812 中,。
3. 切片染色:使用超微切片機(jī)切割后,,用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,以增強(qiáng)對比度,。
4. 觀察記錄:將染色后的切片放入 TEM 中,,觀察并記錄線粒體的形態(tài)變化。
4.2 亞細(xì)胞器變化
鐵死亡發(fā)生時,,伴隨著線粒體膜通透性增加和線粒體膜電位降低,,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)粘度增加和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,以及溶酶體鐵或一氧化氮(NO)的累積,??山柚嚓P(guān)熒光探針,用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測[28],。
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Product Name | Ex/Em (nm) | ||
HY-15534 JC-1 | 線粒體膜電位降低 | 健康細(xì)胞:紅色熒光 鐵死亡細(xì)胞:綠色熒光 | 紅色:585/590 綠色:510/52 |
HY-K0601 JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒 | 線粒體膜電位降低 | 健康細(xì)胞:紅色熒光 鐵死亡細(xì)胞:綠色熒光 提供 (綠色熒光CCCP) 作為陽性對照 | 紅色:585/590 綠色:510/52 |
HY-D0984A TMRM Perchlorate | 線粒體膜電位降低 | 健康細(xì)胞:橙紅色熒光 鐵死亡細(xì)胞:基本無熒光 | 550/580 |
HY-D0084 3,3'-Dihexyloxacarbocyanine iodide | 線粒體膜通透性增加 | 健康細(xì)胞:綠色熒光 鐵死亡細(xì)胞:綠色熒光減弱 | 482/504 |
HY-D1783 MitoTracker Deep Red FM | 線粒體膜通透性增加 | 健康細(xì)胞:紅色熒光 鐵死亡細(xì)胞:紅色熒光減弱 | 548/573 |
05
調(diào)控鐵死亡的基因和蛋白的檢測
鐵死亡主要由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化引起,,其調(diào)控機(jī)制包括多種,主要分為:過氧化代謝部分(如鐵代謝和脂代謝途徑)和抗氧化部分(如 System xc--GSH-GPX4 途徑,AIFM2-CoQ10/GCH1-BH4/ESCRT-III 和 DHODH 途徑),。鐵死亡發(fā)生時,,一些關(guān)鍵基因和蛋白表達(dá)水平會發(fā)生變化,因此,,可采用 Western blot/免疫熒光/免疫組織化學(xué)/實(shí)時熒光定量 PCR 等技術(shù)來表征鐵死亡的發(fā)生,。
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Pathway | Protein | Expression | Antibody | Cat.No. |
鐵代謝 | TFR1 | 上調(diào) | Transferrin Receptor 1 Antibody | HY-P81000 |
鐵代謝 | FTH1 | 下調(diào) | Ferritin Heavy Chain Antibody | HY-P80670 |
鐵代謝 | SLC40A1 | 下調(diào) | SLC40A1 Antibody | HY-P81218 |
脂代謝 | ACSL4 | 上調(diào) | FACL4 Antibody | HY-P80977 |
脂代謝 | ALOX12 | 12 Lipoxygenase Antibody (YA2038) | HY-P82293 | |
脂代謝 | ALOX15 | ALOX15 Antibody (YA1309) | HY-P81564 |
COX2 | COX2/Cyclooxygenase 2 Antibody | HY-P80091 | ||
System xc-- GSH-GPX4 | SLC7A11 | 下調(diào) | xCT Antibody (YA006) | HY-P80935 |
System xc-- GSH-GPX4 | SLC7A11 | 下調(diào) | xCT Antibody (YA652) | HY-P80523 |
System xc-- GSH-GPX4 | 下調(diào) | GPX4 Antibody | HY-P80450 | |
Nrf2 | 上調(diào) | Nrf2 Antibody (YA895) | HY-P81051 | |
FSP1 | AMID/FSP1 Antibody | HY-P80679 |
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[10] Biochem Biophys Res Commun. 2020 Feb 5;522(2):415-421.
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