過度的脂質(zhì)過氧化通過產(chǎn)生有毒的磷脂氫過氧化物（PLOOH）,，在促進(jìn)鐵死亡中起著重要作用,。因此，脂質(zhì)過氧化相關(guān)的生物標(biāo)志物是鐵死亡的關(guān)鍵檢測指標(biāo),。

1.1 脂質(zhì)過氧化物檢測

BODIPY 581/591 C11 是一種脂溶性比率型熒光探針,，能夠嵌入細(xì)胞膜并與細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)相互作用。在未氧化狀態(tài)下,，呈現(xiàn)紅色熒光 (還原型,；Ex=581 nm, Em=591 nm)。

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時,，亞鐵離子 (Fe2+) 和 ROS 促進(jìn)脂質(zhì)氧化,，形成脂質(zhì)過氧化物，BODIPY 581/591 C11 被氧化,，發(fā)射波長從 591 nm 轉(zhuǎn)移到 510 nm,，產(chǎn)生綠色熒光 (氧化型；Ex=500 nm, Em=510 nm),。

需要注意的是,，BODIPY 581/591 C11 對脂溶性膜內(nèi)各種活性氧 (ROS) 和過氧亞硝酸鹽 (ONOO-) 也較為敏感，因此它也可以用于鐵死亡細(xì)胞中 ROS 和 RNS 的檢測,。

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BODIPY 581/591 C11 染色參考

1. 儲備液及工作液的制備:

 (1) 用 DMSO 配制 10 mM BODIPY 581/591 C11 儲備液（-20°C 或 -80°C 避光保存,，避免反復(fù)凍融）,。

 (2) 染色前用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 稀釋儲備液，制備 2-10 μM BODIPY 581/591 C11 工作液

 （請根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整工作液濃度）,。

2. 細(xì)胞染色：

 (1) 細(xì)胞制備

 懸浮細(xì)胞：4°C, 1000 ×g 離心 3-5 分鐘,，棄上清。PBS 洗 2 次,，每次 5 分鐘,。

 貼壁細(xì)胞：棄去培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶解離細(xì)胞,，制成單細(xì)胞懸液。4°C, 1000 ×g 離心 3-5 分鐘,，棄上清,。

 PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘,。

 (2) 加入 1 mL BODIPY 581/591 C11 工作液,，室溫孵育 30 分鐘,。

 (3) 4°C, 400 ×g 離心 3-4 分鐘，棄上清,。PBS 洗 2 次,，每次 5 分鐘。

 (4) 用 1 mL 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 重懸細(xì)胞,，熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測,。

1.2 活性氧的檢測[20]

活性氧（ROS） 在鐵死亡過程中不僅促進(jìn)脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞損傷，還抑制抗氧化信號通路,，是鐵死亡檢測的重要生物標(biāo)志物,。H2DCFDA（DCFH-DA）是一種可滲透細(xì)胞的活性氧探針。進(jìn)入細(xì)胞后,，H2DCFDA 在細(xì)胞內(nèi)脫酯化,，并被 ROS 氧化成具有強(qiáng)烈熒光的 DCF，產(chǎn)生綠色熒光（Ex: 488 nm, Em: 525 nm）,。通過熒光顯微鏡,、流式細(xì)胞儀或分光光度計等設(shè)備可以檢測細(xì)胞內(nèi) ROS 水平。

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H2DCFDA 染色方法參考

1. 儲備液及工作液的制備 :

 (1) 用DMSO配制5mM的H2DCFDA儲備液（-20°C或 -80°C避光保存,，避免反復(fù)凍融）,。

 (2) 染色前用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS稀釋儲備液，配制成1-10μM的H2DCFDA工作液,。

 （請根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整工作液濃度）,。

2. 細(xì)胞染色：

 (1) 懸浮細(xì)胞

 · 離心收集細(xì)胞，保持密度約為1×106

 個,。PBS洗滌兩次,，每次5分鐘。

 · 加入1mL 染料工作液,，室溫孵育5-30分鐘,。

 · 400×g離心3-4分鐘，棄上清,。PBS洗滌細(xì)胞兩次,，每次5分鐘。

 · 用1mL無血清培養(yǎng)基或PBS重懸細(xì)胞,，使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察,。

 (2) 貼壁細(xì)胞

 · 將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于無菌蓋玻片上。

 · 從培養(yǎng)基中移出蓋玻片,，置于載玻片上,，吸除多余培養(yǎng)基。加入 100 μL 染料工作液,，

 輕輕晃動使其完-全覆蓋細(xì)胞,，孵育 5-30 分鐘,。

 · 吸去染料工作液，培養(yǎng)基洗 2-3 次,，每次 5 分鐘,，使用熒光顯微鏡觀察。

注：若需要用流式細(xì)胞儀檢測,，需將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并重懸后再進(jìn)行染色,。

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1.3 過氧化脂質(zhì)衍生物的檢測[21][22]

脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中，大量的脂質(zhì)過氧化初級產(chǎn)物在氧化反應(yīng)中逐漸分解為一系列復(fù)雜的醛類化合物,，包括 MDA,，4-HNE，丙醛和己醛等,。這些活性醛類物質(zhì)能夠攻擊蛋白質(zhì)等生物大分子,，形成加合物，從而引發(fā)細(xì)胞的進(jìn)一步損傷,。

Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit 是一種基于硫代巴比-妥酸 (TBA) 反應(yīng)物法的試劑盒,，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA 與 TBA 在高溫和酸性條件下反應(yīng)，形成一種具有特定顏色的 MDA-TBA 復(fù)合物,，其最大吸收波長通常在 532 nm 處,，可通過比色法來定量檢測脂質(zhì)過氧化水平。

此外,，4-HNE 抗體可以用來定量檢測 4-HNE 水平,。需要注意的是，MDA 和 4-HNE 在除鐵死亡外的多種氧化應(yīng)激狀態(tài)下均可產(chǎn)生,，在實(shí)際應(yīng)用中,，一般與其他檢測方法進(jìn)行相互驗(yàn)證，以提高結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性[10],。

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