一,、背景

放線共生放線桿菌PCR試劑盒是一種用于檢測放線共生放線桿菌的分子生物學(xué)試劑。該試劑盒通常包含用于擴增特定DNA片段的引物,、DNA聚合酶以及其他的必需試劑,，能夠在PCR儀中運行，對特定的DNA序列進行快速,、靈敏的檢測,。

二、放線共生放線桿菌PCR試劑盒實驗操作

1,、放線共生放線桿菌PCR試劑盒模板制備（樣本制備區(qū)）

建議使用配套水生動物病害基因組DNA/RNA提取試劑盒系列產(chǎn)品，具體過程詳見產(chǎn)品說明書,。

2,、添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒中進行）

請于-20℃條件下保存,，有效期12個月

取出所需測試數(shù)的已含有反應(yīng)液A-TSV-I的PCR管,，將試劑解凍，離心30秒,，在管蓋上標記管名（陰性對照管NG,、樣品XX、陽性對照管PG）,。打開管蓋向各管管底分別加入0.8μL B-I及0.2μL R-I,，蓋上陰性對照管管蓋，其他各管分別沿管壁加入2μL模板,，順序為待測樣品模板,、PG-TSV-I，依次蓋好各管管蓋,，離心30秒,，立即進行擴增反應(yīng)。

3,、放線共生放線桿菌PCR試劑盒擴增反應(yīng)（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）

①恒溫儀器63℃條件下反應(yīng)60 min,。待儀器升溫至63℃后，新建程序,，設(shè)置實驗名稱及反應(yīng)時間,，將步驟2中離心后的PCR反應(yīng)管放入恒溫熒光分子檢測儀,，點擊開始檢測。

②若使用熒光定量PCR儀,，則熒光基團選擇FAM,，淬滅基團選擇None，將63℃15 s,，63℃45 s作為一個循環(huán),，于63℃45 s處收集熒光信號，60個循環(huán),。

其他儀器請參照儀器說明書進行設(shè)置,。

4、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系,，在樣品制備室進行）

如果只做1次重復(fù),，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照,，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù),，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍,。

5、數(shù)據(jù)處理

如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線,。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度。

三,、應(yīng)用

放線共生放線桿菌PCR試劑盒可以用于牙周病原菌在牙周病人齦下菌斑中的分布研究：

牙周病原菌在牙周病人銀下菌斑中的分布研究目的應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)分別檢測牙周病人釀下菌斑中的10種牙周病原菌,，觀察其分布特點，并初步分析不同的細菌組合與牙周病的關(guān)系,。

材料與方法：使用放線共生放線桿菌PCR試劑盒將聚合酶鏈式反應(yīng)擴增出牙釀葉琳菌部分165 rRNA基因片段的實驗方法推廣致更多的牙周病病原菌,。根據(jù)各自特異區(qū)的165 rRNA基因(165 rDNA)序列，分別合成10種牙周病病原菌:牙跟葉琳菌(Pg),，福塞類桿菌(Bf),，中間型普里沃菌(Pi)，齒垢密螺旋體(Td),，變黑普里沃菌(Pn),，直型彎曲桿菌(Cr)，溶蝕艾肯菌(Ec)，放線共生放線桿菌(Aa),，黃褐二氧化碳噬纖維菌(C,。)，生痰二氧化碳噬纖維菌(CS)的特異引物,，然后隨機選擇62位患者,，其中牙周健康者16例，慢性邊緣性牙跟炎患者17例,，慢性牙周炎患者29例,，每例選兩個位點，分別取兩份跟下菌斑標本,，共124份樣本,。

同時記錄各病例的一般情況：年齡，性別,，吸煙情況和各項臨床指標:探查袋深,，探診出血情況等，牙周炎患者同時記錄附著水平,。提取菌斑中的DNA,，分別用10對特異引物，TaqDNA聚合酶等以及放線共生放線桿菌PCR試劑盒在適宜的條件和溫度下進行聚合酶鏈式反應(yīng),，反應(yīng)產(chǎn)物在加入0.sug/m1澳化已錠(EB)的1.50rk瓊脂糖凝膠中電泳,，紫外透射儀下進行觀察，采用DLZ000 DNA marker記錄電泳DNA片段大小,，檢測是否出現(xiàn)與特異引物相對應(yīng)的特異擴增帶，以鑒定細菌種類,。用統(tǒng)計軟件分析細菌與病例一般情況與各項臨床指標的關(guān)系,。

結(jié)果：10種牙軍醫(yī)進修學(xué)院碩士學(xué)位論文周病病原菌在各組中都有檢出，其中跟炎組牙跟葉琳菌(Pg),，中間型普里沃菌(pi)和齒垢密螺旋體(Td)的檢出率高于健康組;牙周病組牙齲葉琳菌(Pg),，福塞類桿菌(Bf)，中間型普里沃菌(Pi),，齒垢密螺旋體(Td),，變黑普里沃菌(Pn)和黃褐二氧化碳噬纖維菌(Co)的檢出率高于健康組;牙周病組的中間型普里沃菌(Pi)，齒垢密螺旋體(Td)和變黑普里沃菌(Pn)高于齲炎組,。

隨年齡增大,，齒垢密螺旋體(Td)的檢出率增加;女性齲下菌斑中的牙跟葉琳菌(Pg)檢出率多于男性;不吸煙者患者中檢出較多的牙齲葉琳菌(Pg)。中間型普里沃菌(Pi),、齒垢密螺旋體(Td)和變黑普里沃菌(Pn)與牙周病關(guān)系更為密切,。

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