一,、背景

嗜水氣單胞菌PCR試劑盒適用于檢測的扁桃體,、淋巴結(jié)等組織病變部與健康部交界處組織、全血等標本中嗜水氣單胞菌DNA,，適用于嗜水氣單胞菌感染的輔助診斷,。

嗜水氣單胞菌PCR試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù)，通過設(shè)計一對嗜水氣單胞菌特異性引物,，結(jié)合一條特異性探針,，用熒光PCR技術(shù)對嗜水氣單胞菌的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷,。

二,、嗜水氣單胞菌PCR試劑盒操作步驟

（一）稀釋標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。

1、標記6個離心管,，分別為7,，6，5,，4,，3，2,。

2,、用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭,，下同）,。

3、在7號管中加入5μL陽性對照（濃度為1×10E8拷貝/μL,，試劑盒提供),，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

4、換槍頭,，在6號管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

5、換槍頭,，在5號管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

6、重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品,。放冰上待用,。

（二）樣品DNA的制備

7、用自選方法純化樣品的DNA,，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容,。

8,、如果有N個樣品，則需要進行N+2個樣品提取,，多出的一個用作樣品制備陽性對照管,、另一個用作樣品制備陰性對照管。

（三）設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系,，在樣品制備室進行）

9,、如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標記N+9個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線,。如果做定性分析,，并且只做1次重復(fù)，則標記N+4個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用步稀釋得到的標準曲線系列稀釋液的第4號做模板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10,、在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)）：

（四）數(shù)據(jù)處理

11,、如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸,，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度,。

12、如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線,，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性,，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次,。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40，則為陽性,。

三,、應(yīng)用

嗜水氣單胞菌PCR試劑盒可以用于嗜水氣單胞菌感染后鯉Slc15基因表達研究：

在鯉(Cyprinus carpio)基因組中鑒定出10個Slc15基因家族成員,比較基因組學分析顯示鯉Slc15基因顯著擴增,并驗證了鯉的第四輪全基因組復(fù)制(4R-WGD)。通過進一步系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,證實該基因家族在鯉進化過程中具有高度保守性,。使用半定量RT-PCR法對鯉健康組織中的Slc15基因表達分析,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因表達表現(xiàn)出組織特異性,。

在負責消化吸收的鯉腸道中觀察到Slc15基因具有相對較高的表達水平,表明Slc15基因在營養(yǎng)轉(zhuǎn)運過程中起到關(guān)鍵作用。部分基因拷貝具有相似的表達模式,如Slc15a1b-1/-2,、Slc15a2-1/-2和Slc15a4-1/-2,表明兩個拷貝基因之間的功能可能沒有發(fā)生大的分化,。此外,還觀察到部分拷貝基因之間的表達出現(xiàn)差異,例如Slc15a1a-1/Slc15a1a-2和Slc15a5-1/Slc15a5-2,這些差異反映基因復(fù)制后,不同拷貝之間的功能出現(xiàn)分化,該發(fā)現(xiàn)為鯉全基因組復(fù)制后基因的功能多樣化提供了證據(jù)。

為了研究嗜水氣單胞菌感染后鯉Slc15基因的蛋白表達模式,本研究首先制備鯉Slc15a1a,、Slc15a1b,、Slc15a2-1和Slc15a2-2基因的多克隆抗體,從蛋白質(zhì)水平上探究了上述基因在鯉體內(nèi)免疫應(yīng)答機制中的變化。在對Slc15a1兩個拷貝基因的研究中,采用ELISA法檢測獲得鼠抗Slc15a1a和Slc15a1b的效價分別為8.1×105和2.7×105,。當受到嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染時,鯉Slc15a1a和Slc15a1b的蛋白表達水平與空白對照組相比,分別增加了3.39和2.85倍,說明本實驗制備的多克隆抗體具有較高的親和力和特異性,并表現(xiàn)出較強的免疫原性,能夠及時誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,。

Slc15a1a在嗜水氣單胞菌感染后3 h和6 h迅速做出高表達量響應(yīng),在12 h后開始出現(xiàn)表達水平的下降,但Slc15a1b在3～24 h時卻一直維持著較穩(wěn)定的高表達響應(yīng),這說明Slc15a1a和Slc15a1b之間具有一定的表達差異。在感染過程中,Slc15a1a的表達量基本高于Slc15a1b,。因此Slc15a1a可能是Slc15a1的主效基因,在鯉免疫應(yīng)答過程中起到更加重要的作用,。在對Slc15a2的研究中,也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。

當嗜水氣單胞菌感染后,兩個拷貝基因之間整體具有相似的表達趨勢,說明二者之間可能具有相似的基因功能,。Slc15a2-1雖在3 h時做出低表達響應(yīng),但與Slc15a2-1相比,Slc15a2-2在0 h至48 h之間顯著高表達,可能是作為該基因拷貝中的主效基因,并且從6 h到24 h時,兩個拷貝就一直呈現(xiàn)互補的表達方式,共同表達量維持在較高水平,在面對病原侵害時共同做出有效響應(yīng),。

當嗜水氣單胞菌感染鯉后,實時熒光定量q RT-PCR結(jié)果顯示:幾乎所有的S lc15基因在感染早期都有表達增加的趨勢,并在感染后12 h達到表達水平。在脅迫后的最后兩個階段,表達水平呈直線下降趨勢,并在48 h達到表達水平,。在感染早期,Slc15基因可以在炎癥因子的刺激下積極上調(diào)表達水平,通過“放大”免疫信號,提高機體抵抗外來入侵的防御能力,。因此,激活Slc15基因可能是一種治療鯉嗜水氣單胞菌感染病的有效方法。

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