ELISA屬固相，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個逐步平衡的過程,，因此需經(jīng)擴散

才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此,。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育,。

溫育常采用的溫度有43℃、37℃,、室溫和4℃（冰箱溫度）等,。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。

為加速反應(yīng),，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進行,，但不宜采用更高的溫度,。在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中，以形成多的沉淀,。但因所需時間太長,，在ELISA中一般不予采用。

ELISA檢測試劑盒中一般有3次加樣步聚,，即加標本,，加酶結(jié)合物，加底物,。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。

加標本一般用微量加樣器,，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應(yīng)更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染,，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法 ELISA）需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣,。

也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本,，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保 證混和,。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成,。在ELISA檢測試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),，即加標本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育（incubation）,，有人稱之為孵育,，在ELISA中似不恰當。

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