一、背景

腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒采用SYBR Green染料法實時熒光PCR技術，針對腦膜炎敗血金黃桿菌的基因高度保守區(qū)域設計特異性引物,，用熒光PCR技術對腦膜炎敗血金黃桿菌的核酸進行體外擴增檢測，在反應體系中含腦膜炎敗血金黃桿菌核酸模板的情況下,，PCR反應得以進行并釋放熒光信號,，利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出,，實現(xiàn)檢測結果的定性、定量分析,。

二,、腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒使用方法

1、樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

按照試劑盒操作說明或者臨床樣品處理方法做好樣品前處理,。

1.2 DNA提取

根據(jù)您實驗室的具體情況和樣品類型,，選擇適當?shù)奶崛〔呗苑椒ā榱耸箤嶒灲Y果穩(wěn)定,、有效,、可靠，我們建議使用商品化的試劑盒進行提取,，嚴格按照對應試劑盒說明書進行操作,，樣本核酸提取過程中應避免污染，提取好的模板樣品如不能立即檢測,，建議-15℃以下保存,。推薦采用我們公司研發(fā)生產的試劑盒：細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱法)

2、試劑配制（試劑準備區(qū)）

2.1從-15℃以下冰箱中取出試劑盒平衡到室溫（20～25℃）,，注意避免強光照射,，待溶解后振蕩混勻并低速離心10 s，使用低吸附吸頭分液取樣,，避免試劑損失和浪費。

2.2根據(jù)待檢測樣本總數(shù),，設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照,；樣品每滿7份，多配制1份),。

2.3在適當容積的無菌離心管中加入上述試劑,，充分振蕩混勻后2000 rpm離心10 s，按照20μL/管分裝量將試劑分裝至八聯(lián)PCR反應管中,。

2.4蓋緊八聯(lián)PCR反應管蓋,并注意做好相應標識（請標記在八聯(lián)PCR反應管蓋兩端突出部位,，切勿標記在八聯(lián)PCR反應管蓋中間）。將PCR反應管轉移至樣本準備區(qū),，剩余試劑放回-15℃以下冰箱冷凍保存,。

3、加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的DNA,、陽性質控品,、陰性質控品各取5μL，加入相應的反應管中,，蓋好管蓋,，混勻,，短暫離心，核酸加樣過程中應避免污染,。

4,、PCR擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內。

4.2設置好通道,、樣品信息,，反應體系設置為25μL。

熒光通道選擇：檢測通道熒光染料法(SYBR Green I),，淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可,。

4.3按照腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒說明書設置循環(huán)參數(shù)

5,、腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒結果分析判定

5.1結果分析條件設定

設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時,，根據(jù)分析后圖像調節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節(jié)),、stop值(一般可在5~20范圍內調節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),，重新分析結果,。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,。

可疑：檢測通道Ct值>35.0,，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現(xiàn)Ct值≤38.0和典型擴增曲線者為陽性,，否則為陰性,。

陰性：檢測結果Ct值無Ct值，無明顯的擴增曲線,。

三,、應用

腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒可以用于金黃桿菌臨床分離株耐藥性分析及β-內酰胺酶基因型研究：

1、了解臨床分離金黃桿菌對常用抗菌藥物的耐藥特性;

2,、了解金黃桿菌β-內酰胺酶產生情況;

3,、研究金黃桿菌β-內酰胺酶基因型及分布情況。

材料與方法：菌株來源共收集金黃桿菌52株,其中主要為產吲哚黃桿菌和腦膜膿毒性金桿菌,分別為25株和23株,。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922,、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603,、陰溝腸桿菌029M,、接合試驗受體菌E.coli C600和銅綠假單胞菌pa119均為本科保存菌株。

方法：瓊脂稀釋法測定18種藥物對52株金黃桿菌的抑菌濃度,三紙片增效法,、改良三維試驗法進行金黃桿菌產β-內酰胺酶表型篩查,PCR方法和全編碼基因分析β-內酰胺酶基因型,接合轉移試驗和質粒DNA的檢測了解β-內酰胺酶基因是否具有可轉移性,等電聚焦電泳測定β-內酰胺酶的pI值,。

結果：52株金黃桿菌對碳青霉烯類藥物亞胺培南,、美羅培南的耐藥率為73.1%,氨曲南為90.4%,阿米卡星和β-內酰胺抗生素的耐藥率均大于40%。喹諾酮類藥物加替沙星,、左氧氟沙星耐藥率為11.5%,、9.6%,以及利福平8.7%,均表現(xiàn)出很強的抗菌活性。

金黃桿菌β-內酰胺酶檢測結果,25株產吲哚黃桿菌的表型和PCR方法分別檢測出MBLs 19株和20株,基因型以bla IND-1和bla IND-2為主,分別為9株和10株,菌株C-15攜帶bla IND-1,MBLs表型檢測及β-內酰胺酶初篩均為陰性,。

14株腦膜膿毒性金桿菌表型和PCR方法分別檢測出MBLs 17株,基因型為blaB1,2株;blaB2,5株;blaB3,4株;blaB11,4株;blaGOB-1,1株;blaGOB-10,1株,。僅7株細菌檢出產ESBLs,均為腦膜膿毒性金桿菌,基因型為3株blaCME-1和4株blaCME-2,其中5株細菌同時檢出MBLs。52株細菌均未檢出產AmpC酶,。攜帶β-內酰胺酶基因的金黃桿菌接合試驗均未成功,。質粒DNA均未檢出β-內酰胺酶基因。

結論：

1,、金黃桿菌多重耐藥現(xiàn)象嚴重,對碳青霉烯類等多種抗菌藥物呈高度耐藥;

2,、腦膜膿毒性金桿菌具有較高的ESBLs和MBLs攜帶率,基因型分別以blaCME和blaB為主,可同時攜帶兩種MBLs基因,且blaCME常和MBLs基因同時攜帶;

3、產吲哚黃桿菌具有很高的MBLs檢出率,本地區(qū)攜帶的MBLs基因型以bla IND-1和bla IND-2為主,。

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